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目的

細(xì)菌內(nèi)毒素測(cè)試（BET，Bacterial Endotoxins Testing）的創(chuàng)新技術(shù)問世后，證明平臺(tái)間測(cè)試的等效性就變得至關(guān)重要。“Sievers*Eclipse比例確認(rèn)測(cè)試”旨在確認(rèn)使用96孔微孔板時(shí)的樣品與鱟試劑的1:1比例始終對(duì)使用Eclipse微孔板也同樣有效。只要保持1:1比例，就能使樣品和鱟試劑（LAL，Limulus Amoebocyte Lysate，鱟變形細(xì)胞溶解物）之間的生物化學(xué)反應(yīng)保持不變。即使在使用Sievers Eclipse平臺(tái)時(shí)減少光學(xué)孔的總?cè)莘e，每個(gè)孔中的1:1比例也能保持不變，用戶可以確信樣品和標(biāo)準(zhǔn)品的內(nèi)毒素測(cè)量值是準(zhǔn)確有效的。

背景和重要性

使用96孔微孔板的動(dòng)態(tài)顯色法細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)技術(shù)，要求在每個(gè)孔中加注標(biāo)準(zhǔn)品或樣品與鱟試劑的混合液，然后觀察液體的顏色變化。測(cè)試成功的關(guān)鍵在于精確控制樣品和鱟試劑的用量。USP<85>規(guī)定，對(duì)于某些測(cè)試參數(shù)（例如體積比、反應(yīng)起效時(shí)間、pH值等），應(yīng)遵循鱟試劑生產(chǎn)商提供的使用說明（IFU，Instructions for Use）。

使用說明通常以下兩種方式之一來表明如何達(dá)到正確的樣品和鱟試劑的體積比：

（1）直接表明樣品和鱟試劑的比例應(yīng)為1:1；

（2）指示用戶加入100µL的空白鱟試劑水、內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品、產(chǎn)品樣品、陽性產(chǎn)品對(duì)照，然后向所有使用的孔中加入100µL的鱟試劑。

有的使用說明指示用戶準(zhǔn)備1:1樣品與鱟試劑混合液時(shí)，建議使用100µL（而非典型的200µL）作為孔的總?cè)莘e，并指出100µL有助于達(dá)到最佳的測(cè)試靈敏度。該使用說明表明，1:1的比例關(guān)系（而非孔的總?cè)莘e）才是測(cè)試成功的關(guān)鍵。只要每個(gè)孔中的樣品和鱟試劑的比例是1:1，反應(yīng)就能準(zhǔn)確進(jìn)行，產(chǎn)生的結(jié)果就是等效的。

如果比例不是1:1，那么樣品與鱟試劑的用量就不對(duì)，就會(huì)對(duì)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)過程和整體測(cè)試結(jié)果產(chǎn)生顯著影響。除了孔的總?cè)莘e之外，還需考慮反應(yīng)速度。如果反應(yīng)較快，那么起始反應(yīng)時(shí)間就較短，內(nèi)毒素濃度就較高。如果反應(yīng)較慢，則情況相反——起始反應(yīng)時(shí)間較長，內(nèi)毒素濃度較低。

錯(cuò)誤的比例還會(huì)影響鱟試劑在與樣品混合時(shí)的自然緩沖能力。如果達(dá)不到1:1的精確比例，則反應(yīng)混合液的pH值就不在建議的6-8范圍之內(nèi)，就會(huì)影響測(cè)試的整體反應(yīng)動(dòng)力學(xué)過程。

1:1比例確認(rèn)測(cè)試

1:1比例確認(rèn)測(cè)試旨在證明在Sievers Eclipse微孔板的104個(gè)孔中都達(dá)到了鱟試劑和樣品的1:1精確比例。進(jìn)行測(cè)試時(shí)，用戶需要一個(gè)新的Sievers Eclipse微孔板和Sievers Eclipse 1:1比例確認(rèn)套件（部件號(hào)是STD 85000-01），該套件包括一個(gè)水瓶和一個(gè)染色劑瓶。開始分析之前，Eclipse軟件會(huì)指導(dǎo)用戶在對(duì)應(yīng)的位置和鱟試劑LAL端口，完成水和染色劑的準(zhǔn)備和注射。然后，Eclipse微孔板按照正常分析時(shí)的步驟運(yùn)行。1:1比例確認(rèn)測(cè)試不依賴于動(dòng)力學(xué)酶促反應(yīng)，因此測(cè)試所需的總時(shí)間較短。

1:1比例確認(rèn)測(cè)試的報(bào)告內(nèi)容

分析完畢后，Eclipse軟件的“1:1比例結(jié)果（1:1 Ratio Results）”選項(xiàng)卡中會(huì)顯示報(bào)告。報(bào)告內(nèi)容除了包括在運(yùn)行測(cè)試之前輸入的常規(guī)信息（例如分析儀序列號(hào)、Eclipse微孔板信息、1:1比例確認(rèn)樣品信息），還包括104個(gè)光學(xué)孔的各自的平均光密度。在報(bào)告的“結(jié)果”部分下面，分別顯示微孔板“染色劑”部分和“水”部分的總體平均光密度。染色劑分別同微孔板另一半上的染色劑和水混合，產(chǎn)生上述兩個(gè)平均值。下面的方程1用于計(jì)算總體平均光密度值，該值顯示溶液的混合是否成功。這可以用來表示在正常分析時(shí)樣品和LAL是如何混合的。

在染色劑與水混合的孔中，染色劑被稀釋到原來濃度的一半，理想的比例為0.5（即水平均值）。將這兩個(gè)平均值相除，得出的理想比例為2，表示到達(dá)光學(xué)孔的染色劑和水的量相同。對(duì)于本次測(cè)試來說，1.90至2.10之間的比例都是有效的，不影響整體反應(yīng)動(dòng)力學(xué)曲線和內(nèi)毒素回收率。

結(jié)論

Sievers Eclipse微孔板是精密設(shè)計(jì)的微流控液體處理設(shè)備。此款微孔板利用計(jì)量分配腔，以恒定的通道幾何形狀和運(yùn)動(dòng)方式，將精確等量的樣品和鱟試劑同時(shí)送到光學(xué)孔中。正是Eclipse微孔板的精密的液體控制能力，確保了每次測(cè)試的所有104個(gè)光學(xué)孔中都達(dá)到樣品與鱟試劑的1:1關(guān)鍵性比例。

鱟試劑生產(chǎn)商提供的使用說明可能會(huì)直接表明1:1比例，也可能會(huì)指導(dǎo)用戶混合一定量的樣品和鱟試劑，但液體總體積未必一定是200µL。如果光路徑較長，或者為了進(jìn)行精確移液，生產(chǎn)商會(huì)建議設(shè)置較大容積，以提高測(cè)試精度。對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)的96孔微孔板來說，建議設(shè)置的孔的總?cè)莘e在75-200µL范圍內(nèi)。“為了進(jìn)行有效測(cè)量，建議設(shè)置的微孔板的最小孔容積通常大于最大孔容積的1/3?！?所以，每次測(cè)試的每個(gè)孔中的樣品與鱟試劑的比例達(dá)到1:1，非常重要，而沒有必要使用整個(gè)孔的容積。

在Sievers Eclipse平臺(tái)上進(jìn)行1:1比例確認(rèn)測(cè)試的結(jié)果證明，即使孔的總?cè)莘e顯著減小，每次測(cè)試的每個(gè)光學(xué)孔中都能達(dá)到至關(guān)重要的1:1比例。始終保持1:1的精確比例，用戶就能確認(rèn)在轉(zhuǎn)換平臺(tái)時(shí)，生物化學(xué)過程是等效的。建議每年由Sievers分析儀認(rèn)證的現(xiàn)場(chǎng)服務(wù)工程師或代表來完成此項(xiàng)確認(rèn)測(cè)試任務(wù)。

參考文獻(xiàn)1.Pusterla,Tobias,PhD.“Which is the best microplate for my assay?”BMG Labtech,2018 May 30.

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