線粒體膜電位檢測試劑盒（JC-1法）
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- 公司名稱 南京賽泓瑞生物科技有限公司
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- 廠商性質 生產廠家
- 更新時間 2017/7/12 23:50:21
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細胞凋亡線粒體膜電位檢測試劑盒（JC-1）
（JC-1 Apoptosis Detection Kit）
Cat number：KGA For Research Use Only
Store at-20℃ for one year
Expire date：
一、試劑盒說明
大量的研究表明線粒體與細胞凋亡密切相關，其中線粒體跨膜電位（△y）的破壞，被認為是細胞凋亡級聯(lián)反應過程中zui早發(fā)生的事件之一，它發(fā)生在細胞核凋亡特征（染色質濃縮、DNA斷裂）出現(xiàn)之前，一旦線粒體跨膜電位崩潰，則細胞凋亡不可逆轉。
本試劑盒采用JC-1（5,5’,6,6’-tetrachloro-1,1’,3,3’-tetraethylbenzimidazolcarbocyanine iodide）一種陽離子脂質熒光染料作為檢測線粒體跨膜電位指示劑。JC-1有單體和多聚體兩種存在狀態(tài)，在低濃度時以單體的形式存在，高濃度時以多聚體形式存在，兩者的發(fā)射光譜不同，但均可在流式細胞儀綠色（FL-1）通道檢測出綠色熒光，JC-1可透過正常細胞膜以單體狀態(tài)聚集胞內，正常健康線粒體的膜電位（△y）具有極性，JC-1依賴于△y的極性被迅速攝入線粒體內，并因濃度增高而在線粒體內形成多聚體，多聚體發(fā)射光為紅色熒光；可被流式細胞儀的紅色（FL-2）通道檢測到，而細胞發(fā)生凋亡時，線粒體跨膜電位被去極化，JC-1從線粒體內釋放，紅光強度減弱，以單體的形式存在于胞質內發(fā)綠色熒光。根椐這一特征檢測線粒體膜電位的變化。
本試劑盒可應用于細胞、組織或純化的線粒體膜電位檢測。
二、試劑盒組份
| 組份 | KGA601 （10 assays） | KGA602 （20 assays） | KGA603 （50 assays） | KGA604 100 assays） | 儲存條件 |
| JC-1 | 10μL | 20μL | 50μL | 100μL | 4℃避光 |
| 10×Incubation Buffer | 2.0 mL | 4.0 mL | 10 mL | 20 mL | 4℃ |
三、試劑盒以外自備儀器和試劑
流式細胞儀或熒光顯微鏡、高速離心機、CO2培養(yǎng)箱、微量移液器
1.5m L Microtube、載玻片、蓋玻片（熒光顯微鏡觀察需用）、PBS、滅菌去離子水
四、使用注意事項
1． 微量試劑取用前請離心集液。
2． JC-1避光保存及使用。
3．細胞培養(yǎng)的數(shù)量不宜超過1×106，否則細胞會產生自然凋亡影響檢測。
4．對PH變化過于敏感的細胞建議用胎牛血清取代Buffer孵育染色及洗滌，或延長觀測時間
5．流式細胞儀檢測線粒體膜電位變化受到多種因素的影響，因誘導劑、細胞株類型，作用時間的不同而熒光強度比例都有不同，因此沒有通用標準的補償設門指南，因此每個試驗需設陰性及陽性對照組進行熒光補償及設門。
6．組織需先制備單細胞懸液或提取純化線粒體后方可進行檢測，可選用凱基細胞懸液制備試劑盒（KGA829）或線粒體提取試劑盒（KGA827）。
五、操作方法
1． 用適當?shù)姆椒ㄕT導細胞凋亡，同時設立陰性對照組和陽性對照組【用適當?shù)牡蛲稣T導劑（如星形孢菌素，staurosporine），誘導適當時間后經其它檢測（如AnnexinV或 Caspase 3活性）證實確有凋亡產生】，收集細胞；
2． 用PBS洗滌細胞二次（離心2000rpm，5min），收集不多于1×106的細胞；
3． 取100μL 10× Incubation Buffer加900μL滅菌去離子水稀釋成1× Incubation Buffer，混勻并預熱至37℃；
4． 吸取500μL 1× Incubation Buffer，加入1μL JC-1，渦旋混勻配成JC-1工作液；
【因JC-1在水中的溶解度很小，所以可以通過離心的方法（10，000rpm，1min）去除不溶的顆粒，吸取離心后的上清使用，以消除干擾】
5． 取500μL JC-1工作液將細胞均勻懸浮，37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育15~20min；
6． 室溫離心（2000rpm，5min）收集細胞，用1× Incubation Buffer洗兩次；
7． 吸取500μL 1× Incubation Buffer重新懸浮細胞；
8． 熒光顯微鏡觀察或流式細胞儀分析。
A． 熒光顯微鏡觀察
1． 滴一滴上述細胞懸液于載玻片，蓋上蓋玻片，于熒光顯微鏡下觀察；
2． 對于貼壁細胞來說，也可直接用蓋玻片來培養(yǎng)細胞并誘導細胞凋亡；用PBS洗滌細胞兩次；
滴加100μL JC-1工作液，加蓋玻片，37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育15~20min；1× Incubation Buffe洗滌1~2遍；將蓋玻片倒置于載玻片上，于熒光顯微鏡下觀察；
正常細胞：雙色濾光片觀察則為：綠++ 紅++（高綠高紅），如在同一濾光片下觀察則為黃綠色
凋亡細胞：雙色濾光片觀察則為：綠++ 紅+（高綠低紅），如在同一濾光片下觀察則為綠色
B． 流式細胞儀分析
用流式細胞儀檢測（Ex=488 nm; Em=530 nm）細胞凋亡的情況，綠色熒光通過FITC通道通常為FL1來檢測；紅色熒光通過PI通道通常為FL2來檢測。.正常細胞{FL-1亮,FL-2亮; R1}，凋亡細胞 {FL-1亮, FL-2暗; R2}，設門的位置根椐細胞種類、實驗條件等不同而變化，試驗需設未經處理的正常細胞為陰性對照組和陽性對照組，根椐陰性和陽性對照組的雙參數(shù)散點圖來設定門的位置。
六、實驗范例
用凋亡誘導劑誘導P388細胞凋亡，在37oC，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)4~6h，利用凱基細胞凋亡線粒體膜電位檢測試劑盒（JC-1）進行檢測，通過流式細胞儀分析分析結果如下。
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