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Annexin V-EGFP/PI雙染細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（膜聯(lián)蛋白A5-綠色熒光蛋白/碘化丙啶細(xì)胞凋
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- 更新時(shí)間 2017/7/11 10:43:54
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一、試劑盒說(shuō)明
在正常細(xì)胞中，磷脂酰絲氨酸（PS）只分布在細(xì)胞膜脂質(zhì)雙層的內(nèi)側(cè)，而在細(xì)胞凋亡早期，細(xì)胞膜中的磷脂酰絲氨酸（PS）由脂膜內(nèi)側(cè)翻向外側(cè)。Annexin V是一種分子量為35~36kD的Ca2+依賴性磷脂結(jié)合蛋白，與磷脂酰絲氨酸有高度親和力，故可通過(guò)細(xì)胞外側(cè)暴露的磷脂酰絲氨酸與凋亡早期細(xì)胞的胞膜結(jié)合。因此Annexin V被作為檢測(cè)細(xì)胞早期凋亡的靈敏指標(biāo)之一。將Annexin V進(jìn)行熒光素（EGFP、FITC）標(biāo)記，以標(biāo)記了的Annexin V作為熒光探針，利用熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀可檢測(cè)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。與FITC的綠色熒光信號(hào)相比，EGFP的綠色熒光信號(hào)具有信號(hào)強(qiáng)，不易淬滅，穩(wěn)定性高等優(yōu)點(diǎn)，故本試劑盒采用EGFP作為熒光標(biāo)記探針。碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）是一種核酸染料，它不能透過(guò)完整的細(xì)胞膜，但對(duì)凋亡中晚期的細(xì)胞和死細(xì)胞，PI能夠透過(guò)細(xì)胞膜而使細(xì)胞核染紅。因此將Annexin V與PI匹配使用，就可以將處于不同凋亡時(shí)期的細(xì)胞區(qū)分開(kāi)來(lái)。
本試劑盒可應(yīng)用于培養(yǎng)細(xì)胞凋亡檢測(cè)（不*用于檢測(cè)組織樣本）。
二、試劑盒組份
| 組份 | Cat: KGA101 10 assays | Cat: KGA102 20 assays | Cat: KGA103 50 assays | Cat: KGA104 100 assays | 儲(chǔ)存條件 |
| AnnexinV-EGFP | 50μL | 100μL | 250μL | 500μL | 4℃避光 |
| Propidium Iodide | 50μL | 100μL | 250μL | 500μL | 4℃避光 |
| Binding Buffer | 5 mL | 10.0 mL | 25 mL | 50 mL | 4℃ |
三、試劑盒以外自備儀器和試劑
流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡、低速離心機(jī)、微量移液器
1.5m L Microtube、載玻片、蓋玻片（熒光顯微鏡觀察需用）、PBS、不含EDTA的胰酶消化液
四、使用注意事項(xiàng)
1． 微量試劑取用前請(qǐng)離心集液。
2． Annexin V-EGFP，Propidium Iodide（PI）避光保存及使用。
3． Propidium Iodide （PI）有毒，操作時(shí)請(qǐng)戴手套。
4． 本試劑盒適用于檢測(cè)活細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)時(shí)，細(xì)胞數(shù)量不應(yīng)低于1×105，，不*用于檢測(cè)組織樣本。
5． *使用懸浮培養(yǎng)細(xì)胞。如果是貼壁細(xì)胞，需用不含EDTA的胰酶消化，如消化不當(dāng)，可能引起假陽(yáng)性，而用細(xì)胞刮子會(huì)造成細(xì)胞粘連成團(tuán)，而影響檢測(cè)?？蓪⒁让赶蠹?xì)胞的保存在含2%BSA的PBS中，防止進(jìn)一步的損傷。
6． 細(xì)胞固定后可能導(dǎo)致熒光的淬滅，請(qǐng)不要固定樣品。
7． 因檢測(cè)細(xì)胞的類型、凋亡誘導(dǎo)劑種類、使用的檢測(cè)儀器不同，因而流式檢測(cè)的熒光補(bǔ)償也不同，因此建議每次檢測(cè)均需使用未經(jīng)凋亡誘導(dǎo)處理的細(xì)胞作為對(duì)照，進(jìn)行熒光補(bǔ)償?shù)恼{(diào)節(jié)。
五、操作方法
1． 懸浮細(xì)胞離心（2000rpm離心5min）收集；貼壁細(xì)胞用不含EDTA的胰酶消化收集（注：胰酶消化時(shí)間不易過(guò)長(zhǎng)，否則容易引起假陽(yáng)性）；
2． 用PBS洗滌細(xì)胞二次（2000rpm離心5min）收集1~5×105細(xì)胞；
3． 加入500μL的Binding Buffer懸浮細(xì)胞；
4． 加入5μL Annexin V-EGFP混勻后，加入5 μL Propidium Iodide，混勻；
5． 室溫、避光、反應(yīng)5～15min；
6． 請(qǐng)?jiān)?/span>1 hour內(nèi)，進(jìn)行下述熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀的觀察和檢測(cè)。
A． 熒光顯微鏡觀察
1． 滴一滴上述染色后的細(xì)胞懸液于載玻片上，并用蓋玻片蓋上細(xì)胞；
2． 對(duì)于貼壁細(xì)胞來(lái)說(shuō)，也可直接用蓋玻片來(lái)培養(yǎng)細(xì)胞并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；
（1） 將細(xì)胞于蓋玻片上生長(zhǎng)，用適當(dāng)?shù)牡蛲稣T導(dǎo)劑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并設(shè)立陰性對(duì)照組；
（2） 用PBS洗滌細(xì)胞兩次；
（3） 在500μL 的Binding Buffer中加入5μL Annexin V-EGFP， 5 μL Propidium Iodide，混勻；
（4） 將上述溶液滴加于蓋玻片表面，使蓋玻片表面均勻覆蓋；
（5） 避光、室溫反應(yīng)5 min。
3． 將蓋玻片倒置于載玻片上，于熒光顯微鏡下、雙色濾光片（FITC和羅丹明）觀察
Annexin V-EGFP熒光信號(hào)呈綠色，PI熒光信號(hào)呈紅色。
B． 流式細(xì)胞儀分析
用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，激發(fā)波長(zhǎng)Ex=488 nm; 發(fā)射波長(zhǎng)Em=530 nm。
Annexin V-EGFP的綠色熒光通過(guò)FITC通道（FL1）檢測(cè)；PI紅色熒光通過(guò)PI通道（FL2或FL3）檢測(cè)，建議使用FL3。
熒光補(bǔ)償調(diào)節(jié)：使用未經(jīng)凋亡誘導(dǎo)處理的正常細(xì)胞，作為對(duì)照進(jìn)行熒光補(bǔ)償調(diào)節(jié)去除光譜重疊和設(shè)定十字門(mén)的位置。
六、實(shí)驗(yàn)范例
用凋亡誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)P388細(xì)胞凋亡，在37oC，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)4～6h后，參照說(shuō)明書(shū)的操作方法進(jìn)行檢測(cè)，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)下圖。
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