微生物限度檢測(cè)儀CYW-300B 薄膜過(guò)濾法　微生物的檢測(cè)，無(wú)論在理論研究還是在生產(chǎn)實(shí)踐中都具有重要的意義，本文對(duì)生長(zhǎng)量測(cè)定法、微生物計(jì)數(shù)法、生理指標(biāo)法和商業(yè)化快速微生物檢測(cè)簡(jiǎn)要介紹了利用微生物重量，體積，大小，生理代謝物等指標(biāo)的二十余種常用的檢測(cè)方法，簡(jiǎn)要介紹了這些方法的原理，應(yīng)用范圍和優(yōu)缺點(diǎn)。
　　一個(gè)微生物細(xì)胞在合適的外界條件下，不斷的吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，并按自己的代謝方式進(jìn)行新陳代謝。如果同化作用的速度超過(guò)了異化作用，則其原生質(zhì)的總量（重量，體積，大小）就不斷增加，于是出現(xiàn)了個(gè)體的生長(zhǎng)現(xiàn)象。如果這是一種平衡生長(zhǎng)，即各細(xì)胞組分是按恰當(dāng)?shù)谋壤鲩L(zhǎng)時(shí)，則達(dá)到程度后就會(huì)發(fā)生繁殖，從而引起個(gè)體數(shù)目的增加，這時(shí)，原有的個(gè)體已經(jīng)發(fā)展成一個(gè)群體。隨著群體中各個(gè)個(gè)體的進(jìn)一步生長(zhǎng)，就引起了這一群體的生長(zhǎng)，這可從其體積、重量、密度或濃度作指標(biāo)來(lái)衡量。微生物的生長(zhǎng)不同于其他生物的生長(zhǎng)，微生物的個(gè)體生長(zhǎng)在科研上有困難，通常情況下也沒(méi)有實(shí)際意義。微生物是以量取勝的，因此，微生物的生長(zhǎng)通常指群體的擴(kuò)增。微生物的生長(zhǎng)繁殖是其在內(nèi)外各種環(huán)境因素相互作用下的綜合反映。因此生長(zhǎng)繁殖情況就可作為研究各種生理生化和遺傳等問(wèn)題的重要指標(biāo)，同時(shí)，微生物在生產(chǎn)實(shí)踐上的各種應(yīng)用或是對(duì)致病，霉腐微生物的防治都和他們的生長(zhǎng)抑制緊密相關(guān)。所以有必要介紹一下微生物生長(zhǎng)情況的檢測(cè)方法。既然生長(zhǎng)意味著原生質(zhì)含量的增加，所以測(cè)定的方法也都直接或間接的以次為根據(jù)，而測(cè)定繁殖則都要建立在計(jì)數(shù)這一基礎(chǔ)上。微生物生長(zhǎng)的衡量，可以從其重量，體積，密度，濃度，做指標(biāo)來(lái)進(jìn)行衡量。微生物限度檢測(cè)儀CYW-300B 薄膜過(guò)濾法
　　1. 微生物計(jì)量法
　　1.1 體積測(cè)量法
　　又稱測(cè)菌絲濃度法，通過(guò)測(cè)定體積培養(yǎng)液中所含菌絲的量來(lái)反映微生物的生長(zhǎng)狀況。方法是，取量的待測(cè)培養(yǎng)液（如10 mL）放在有刻度的離心管中，設(shè)定的離心時(shí)間（如5 min）和轉(zhuǎn)速（如5000 rpm），離心后，倒出上清夜，測(cè)出上清夜體積為v，則菌絲濃度為（10-v）/10。菌絲濃度測(cè)定法是大規(guī)模工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)上微生物生長(zhǎng)的一個(gè)重要監(jiān)測(cè)指標(biāo)。這種方法比較粗放，簡(jiǎn)便，快速，但需要設(shè)定一致的處理?xiàng)l件，否則偏差很大，由于離心沉淀物中夾雜有一些固體營(yíng)養(yǎng)物，結(jié)果會(huì)有偏差。
　　稱干重法
　　可用離心或過(guò)濾法測(cè)定。一般干重為濕重的10~20%。在離心法中，將體積待測(cè)培養(yǎng)液倒入離心管中，設(shè)定的離心時(shí)間和轉(zhuǎn)速，進(jìn)行離心，并用清水離心洗滌1~5次，進(jìn)行干燥。干燥可用烘箱在105 ℃或100 ℃下烘干，或采用紅外線烘干，也可在80 ℃或40 ℃下真空干燥，干燥后稱重。如用過(guò)濾法，絲狀真菌可用濾紙過(guò)濾，細(xì)菌可用醋酸纖維膜等濾膜過(guò)濾，過(guò)濾后用少量水洗滌，在40 ℃下進(jìn)行真空干燥。稱干重發(fā)法較為煩瑣，通常獲取的微生物產(chǎn)品為菌體時(shí)，常采用這種方法，如活性（Activity Dry Yeast, ADY）,一些以微生物菌體為活性物質(zhì)的飼料和肥料。
　　1.3 比濁法
　　微生物的生長(zhǎng)引起培養(yǎng)物混濁度的增高。通過(guò)紫外分光光度計(jì)測(cè)定波長(zhǎng)下的吸光值，判斷微生物的生長(zhǎng)狀況。對(duì)某一培養(yǎng)物內(nèi)的菌體生長(zhǎng)作定時(shí)跟蹤時(shí)，可采用一種特制的有側(cè)臂的三角燒瓶。將側(cè)臂插入光電比色計(jì)的比色座孔中，即可隨時(shí)測(cè)定其生長(zhǎng)情況，而不必取菌液。該法主要用于發(fā)酵工業(yè)菌體生長(zhǎng)監(jiān)測(cè)。如使用UNICO公司的紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)，在波長(zhǎng)600 nm處用比色管定時(shí)測(cè)定發(fā)酵液的吸光光度值OD600，以此監(jiān)控E.coli的生長(zhǎng)及誘導(dǎo)時(shí)間。
　　1.4 菌絲長(zhǎng)度測(cè)量法
　　對(duì)于絲狀真菌和一些放線菌，可以在培養(yǎng)基上測(cè)定時(shí)間內(nèi)菌絲生長(zhǎng)的長(zhǎng)度，或是利用一只一端開(kāi)口并帶有刻度的細(xì)玻璃管，到入合適的培養(yǎng)基，臥放，在開(kāi)口的一端接種微生物，一段時(shí)間后記錄其菌絲生長(zhǎng)長(zhǎng)度，借此衡量絲狀微生物的生長(zhǎng)。
　　2. 微生物計(jì)數(shù)法
　　2.1 血球計(jì)數(shù)板法
　　血球計(jì)數(shù)板是一種有結(jié)構(gòu)刻度和厚度的厚玻璃片，玻片上有四條溝和兩條嵴，中央有一短橫溝和兩個(gè)平臺(tái)，兩嵴的表比兩平臺(tái)的表面高0.1 mm，每個(gè)平臺(tái)上刻有不同規(guī)格的格網(wǎng)，中央0.1 mm2面積上刻有400個(gè)小方格。通過(guò)油鏡觀察，統(tǒng)計(jì)大格內(nèi)微生物的數(shù)量，即可算出1 mL菌液中所含的菌體數(shù)。這種方法簡(jiǎn)便，直觀，快捷，但只適宜于單細(xì)胞狀態(tài)的微生物或絲狀微生物所產(chǎn)生的孢子進(jìn)行計(jì)數(shù)，并且所得結(jié)果是包括死細(xì)胞在內(nèi)的總菌數(shù)。
　　2.2 染色計(jì)數(shù)法
　　為了彌補(bǔ)一些微生物在油鏡下不易觀察計(jì)數(shù)，而直接用血球計(jì)數(shù)板法又無(wú)法區(qū)分死細(xì)胞和活細(xì)胞的不足，人們發(fā)明了染色計(jì)數(shù)法。借助不同的染料對(duì)菌體進(jìn)行適當(dāng)?shù)娜旧?，可以更方便的在顯微鏡下進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。如酵母活細(xì)胞計(jì)數(shù)可用美藍(lán)染色液，染色后在顯微鏡下觀察，活細(xì)胞為無(wú)色，而死細(xì)胞為藍(lán)色。
　　2.3 比例計(jì)數(shù)法
　　將已知顆粒（如霉菌孢子或紅細(xì)胞）濃度的液體與一待測(cè)細(xì)胞濃度的菌液按比例均勻混合，在顯微鏡視野中數(shù)出各自的數(shù)目，即可得未知菌液的細(xì)胞濃度。這種計(jì)數(shù)方法比較粗放。并且需要配制已知顆粒濃度的懸液做標(biāo)準(zhǔn)。
　　2.4 液體稀釋法
　　對(duì)未知菌樣做連續(xù)十倍系列稀釋，根據(jù)估計(jì)數(shù)，從適宜的三個(gè)連續(xù)的10倍稀釋液中各取5 mL試樣，接種1 mL到3組共15只裝培養(yǎng)液的試管中，經(jīng)培養(yǎng)后記錄每個(gè)稀釋度出現(xiàn)生長(zhǎng)的試管數(shù)，然后查大或然數(shù)表MPN（Most Probable Number）得出菌樣的含菌數(shù)，根據(jù)樣品稀釋倍數(shù)計(jì)算出活菌含量。該法常用于食品中微生物的檢測(cè)，例如飲用水和牛奶的微生物。
　　2.5 平板菌落計(jì)數(shù)法
　　這是一種常用的活菌計(jì)數(shù)法。將待測(cè)菌液進(jìn)行梯度稀釋，取體積的稀釋菌液與合適的固體培養(yǎng)基在凝固前均勻混合，或?qū)⒕和坎加谝涯痰墓腆w培養(yǎng)基平板上。保溫培養(yǎng)后，用平板上出現(xiàn)的菌落數(shù)乘以菌液稀釋度，即可算出原菌液的含菌數(shù)。一般以直徑9 cm的平板上出現(xiàn)50~500個(gè)菌落為宜。但方法比較麻煩，操作者需有熟練的技術(shù)。平板菌落計(jì)數(shù)法不僅可以得出菌液中活菌的含菌數(shù)，而且同時(shí)將菌液中的細(xì)菌進(jìn)行了一次分離培養(yǎng)，獲得了單克隆。
　　2.6 試劑紙
　　在平板計(jì)數(shù)法的基礎(chǔ)上，發(fā)展了小型商品化產(chǎn)品以供快速計(jì)數(shù)用。形式有小型厚濾紙片，瓊脂片等。在濾紙和瓊脂片中吸有合適的培養(yǎng)基，其中加入活性指示劑2, 3, 5-氯化三苯基四氮唑（TTC，無(wú)色）待蘸取測(cè)試菌液后置密封包裝袋中培養(yǎng)。短期培養(yǎng)后在濾紙上出現(xiàn)密度的玫瑰色微小菌落與標(biāo)準(zhǔn)紙色板上圖譜比較即可估算出樣品的含菌量。試劑紙法計(jì)數(shù)快捷準(zhǔn)確，相比而言避免了平板計(jì)數(shù)法的人為操作誤差。
　　2.7 膜過(guò)濾法
　　用特殊的濾膜過(guò)濾體積的含菌樣品，經(jīng)丫叮橙染色，在紫外顯微鏡下觀察細(xì)胞的熒光，活細(xì)胞會(huì)發(fā)橙色熒光，而死細(xì)胞則發(fā)綠色熒光。
　　3. 間接測(cè)定法
　　微生物的生長(zhǎng)伴隨著一系列生理指標(biāo)發(fā)生變化，例如酸堿度，發(fā)酵液中的含氮量，含糖量，產(chǎn)氣量等，與生長(zhǎng)量相平行的生理指標(biāo)很多，它們可作為生長(zhǎng)測(cè)定的相對(duì)值。因此可利用生理指標(biāo)等間接參數(shù)來(lái)測(cè)定生物量。
　　3.1 測(cè)定含氮量
　　大多數(shù)細(xì)菌的含氮量為干重的12.5%，酵母為7.5%，霉菌為6.0%。根據(jù)含氮量×6.25，即可測(cè)定粗蛋白的含量。含氮量的測(cè)定方法有很多，如用硫酸，過(guò)氯酸，碘酸，磷酸等消化法和Dumas測(cè)N2氣法。Dumas測(cè)N2氣法是將樣品與CuO混合，在CO2氣流中加熱后產(chǎn)生氮?dú)?，收集在呼吸?jì)中，用KOH吸去CO2后即可測(cè)出N2的量。
　　3.2 測(cè)定含碳量
　　將少量（干重0.2~2.0 mg）生物材料混入1 mL水或無(wú)機(jī)緩沖液中，用2 mL 2%的K2Cr2O7溶液在100 ℃下加熱30分鐘后冷卻。加水稀釋至5 mL，在580 nm的波長(zhǎng)下讀取吸光光度值，即可推算出生長(zhǎng)量。需用試劑做空白對(duì)照，用標(biāo)準(zhǔn)樣品做標(biāo)準(zhǔn)曲線。
　　還原糖測(cè)定法
　　還原糖通常是指單糖或寡糖，可以被微生物直接利用，通過(guò)還原糖的測(cè)定可間接反映微生物的生長(zhǎng)狀況，常用于大規(guī)模工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)上微生物生長(zhǎng)的常規(guī)監(jiān)測(cè)。方法是，離心發(fā)酵液，取上清液，加入斐林試劑，沸水浴煮沸3分鐘，取出加少許鹽酸酸化，加入Na2S2O3臨近終點(diǎn)時(shí)加入淀粉溶液，繼續(xù)加Na2S2O3至終點(diǎn)，查表讀出還原糖的含量。
　　3.4 氨基氮的測(cè)定
　　離心發(fā)酵液，取上清液，加入甲基紅和鹽酸作指示劑，加入0.02 mol/L的NaOH調(diào)色至顏色剛剛褪去，加入底物18%的中性甲醛，反應(yīng)數(shù)刻，加入0.02 mol/L的使之變色，根據(jù)NaOH的用量折算出氨基氮的含量。根據(jù)培養(yǎng)液中氨基氮的含量，可間接反映微生物的生長(zhǎng)狀況。
　　3.5 其他生理物質(zhì)的測(cè)定
　　P，DNA，RNA，ATP，NAM（乙酰胞壁酸）等含量以及產(chǎn)酸，產(chǎn)氣，產(chǎn)CO2（用標(biāo)記葡萄糖做基質(zhì)），耗氧，黏度，產(chǎn)熱等指標(biāo)，都可用于生長(zhǎng)量的測(cè)定。也可以根據(jù)反應(yīng)前后的基質(zhì)濃度變化，終產(chǎn)氣量，微生物活性三方面的測(cè)定反映微生物的生長(zhǎng)。如在BMP-2的發(fā)酵生產(chǎn)上，隨時(shí)監(jiān)測(cè)溶氧量的變化和酸堿度的變化，判斷細(xì)菌的長(zhǎng)勢(shì)。
　　4. 商業(yè)化快速微生物檢測(cè)法
　　微生物的檢測(cè)，其發(fā)展方向是快速，準(zhǔn)確，簡(jiǎn)便，自動(dòng)化，當(dāng)前很多生物制品公司利用傳統(tǒng)微生物檢測(cè)原理，結(jié)合不同的檢測(cè)方法，設(shè)計(jì)了形式各異的微生物檢測(cè)儀器設(shè)備，正逐步廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)微生物檢測(cè)和科學(xué)研究領(lǐng)域。例如：
　　4.1 試劑盒，培養(yǎng)基等手段
　　抗干擾培養(yǎng)基和微生物數(shù)量快速檢測(cè)技術(shù)結(jié)合解決了傳統(tǒng)微生物檢測(cè)手段不能解決的難題，為建立一套完整的抗干擾微生物檢測(cè)系統(tǒng)奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。如：抗干擾微生物培養(yǎng)基，新型生化鑒定管，微生物計(jì)數(shù)卡，環(huán)境質(zhì)量檢測(cè)試劑盒等，可方便的用于多項(xiàng)檢測(cè)。
　　4.2 借助新型儀器
　　BACTOMETER全自動(dòng)各類總菌數(shù)及快速細(xì)菌檢測(cè)系統(tǒng)可以數(shù)小時(shí)內(nèi)獲得監(jiān)測(cè)結(jié)果，樣本顏色及光學(xué)特征都不影響讀數(shù)，對(duì)酵母和霉菌檢測(cè)同樣高度敏感原理是利用電阻抗法（Impedance Technology）將待測(cè)樣本與培養(yǎng)基置于反應(yīng)試劑盒內(nèi)，底部有一對(duì)不銹鋼電極，測(cè)定因微生物生長(zhǎng)而產(chǎn)生阻抗改變。如微生物生長(zhǎng)時(shí)可將培養(yǎng)基中的大分子營(yíng)養(yǎng)物經(jīng)代謝轉(zhuǎn)變?yōu)榛钴S小分子，電阻抗法可測(cè)試這種微弱變化，從而比傳統(tǒng)平板法更快速監(jiān)測(cè)微生物的存在及數(shù)量。測(cè)定項(xiàng)目包括總生菌數(shù)，酵母菌，大腸桿菌群，霉菌，乳酸菌，嗜熱菌，革蘭氏陰性菌，等。
　　微生物OD值是反映菌體生長(zhǎng)狀態(tài)的一個(gè)指標(biāo)，OD是Optical Density（光密度）的縮寫，表示被檢測(cè)物吸收掉的光密度。通常400～700 nm 都是微生物測(cè)定的范圍，需要紫外分光光度計(jì)測(cè)大吸收波長(zhǎng)。用得多的是：505 nm測(cè)菌絲菌體、560 nm測(cè)酵母、600 nm測(cè)細(xì)菌。用測(cè)OD方法畫微生物生長(zhǎng)曲線時(shí)，同一株菌的起始培養(yǎng)濃度可以準(zhǔn)備多管（根據(jù)檢測(cè)點(diǎn)的需要，如需檢測(cè)10個(gè)點(diǎn)，就準(zhǔn)備10管），然后每個(gè)點(diǎn)取一管出來(lái)測(cè)OD值就行了。
　　一般測(cè)菌體密度的OD的波長(zhǎng)范圍是580 nm-660 nm，如枯草芽孢桿菌用600 nm，已經(jīng)屬于可見(jiàn)光區(qū)（200 nm～400 nm為紫外光區(qū)，400 nm～800 nm為可見(jiàn)光區(qū)）?？瞻兹缬盟?，需要離心洗滌菌體；空白如用不接種的培養(yǎng)基做就不需要洗滌，但是不接種的培養(yǎng)基要和接種的同時(shí)培養(yǎng)以求條件一致，后注意一般OD值在控制在0.1~0.4好，在這個(gè)區(qū)內(nèi)的值就可靠，如果OD大于1.0，一般要稀釋后再測(cè)，因?yàn)镺D太大，分光光度計(jì)的靈敏度就會(huì)顯著降低。
　　一般都測(cè)吸光值，而且好是整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，保持發(fā)酵液或菌體的稀釋倍數(shù)一致，吸光值與稀釋倍數(shù)不成正比，可保證整個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)有可比性。且取值的時(shí)候要連續(xù)讀數(shù)，重復(fù)3次的數(shù)好。
　　另，用分光光度計(jì)測(cè)微生物的OD值為什么要把波長(zhǎng)設(shè)為600 nm
　　這個(gè)波長(zhǎng)其實(shí)只是針對(duì)濁度，而分光光度計(jì)在600 nm處對(duì)濁度的反應(yīng)比較靈敏。測(cè)吸收峰的實(shí)際意義并不大，比如LB搖瓶培養(yǎng)過(guò)夜的大腸桿菌，其實(shí)在400多納米處的吸收大，但那很可能是培養(yǎng)液的吸收峰。