梭狀芽孢桿菌是一種復雜的具有多樣性的細菌群，主要是由能形成孢子的革蘭氏陽性、厭氧、桿狀細菌組成。梭狀芽孢桿菌在長時間內因肉毒梭菌（Clostridium botulinum）中毒、破傷風梭菌（Clostridium tetani）感染和產(chǎn)氣芽孢梭菌（Clostridium perfringens）引起食物中毒等原因，被劃分在有害菌群中。但隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)丁酸梭菌（Clostridium butyricum）、拜氏梭菌（Clostridium beijerinckii）、丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)等產(chǎn)生的有益代謝物，不僅可以推動可再生能源相關主題研究的發(fā)展，還可以促進腸道穩(wěn)態(tài)，保障人體健康。但梭菌的低轉化效率以及合成生物學工具和遺傳部件的匱乏使得梭狀芽孢桿菌屬進行代謝工程非常困難。因此，隨著梭狀芽孢桿菌的關注度度越來越高，對成熟遺傳轉化方法的需求也越來越迫切^[1]。

復制子（Replicon）是復制質粒的關鍵元件，它可以影響質?？截悢?shù)和遺傳穩(wěn)定性，進而對基因表達、宿主代謝和最終產(chǎn)物形成產(chǎn)生巨大影響。目前在梭菌的研究中主要選擇的方式是結合轉移，因此在載體設計上必須同時兼顧革蘭氏陰性復制子和革蘭氏陽性復制子^[2]。本文主要介紹四種常見梭菌復制子在梭菌遺傳轉化中的歷史和作用。

在梭菌的研究上，1981年Minton等人從丁酸梭菌中分離并鑒定了具有復制功能的pCB102復制子； 1986年Monod等人從枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）中分離得到復制子pIM13； 1998年Davis等人從肉毒梭菌中分離并初步鑒定了pBP1的復制功能，隨后在2006年，Pennington等人發(fā)現(xiàn)pPB1在生孢梭菌（Clostridium sporogenes）中同樣具有復制功能。2002年Purdy等人從艱難梭菌（Clostridium difficile）中分離并鑒定到復制子pCD6。在已發(fā)現(xiàn)并得到的復制子基礎上，為使整個轉化體系更規(guī)范和統(tǒng)一，針對不同的復制子改造了不同的梭菌專用質粒。如：質粒PMTL82151的復制子是pBP1; 質粒PMTL83151的復制子是pCB102；質粒PMTL84151的復制子是pCD6；質粒PMTL85151的復制子是pIM13^[3]。

為了解不同復制子和篩選抗性在不同梭菌中的作用，Heap等人在2009年采用具有不同復制子的質粒和篩選抗性對肉毒梭菌、丙酮丁醇梭菌和艱難梭菌進行轉化。結果表明，在結合轉移的篩選過程中，主要選擇catP；ermB；aad9和tetA四種基因對應抗生素，其中 catP和ermB的適用范圍相對更普遍(Table 5)。肉毒梭菌在帶有pBP1和pCB102復制子的轉化體系中，獲得陽性克隆的效率遠高于pCD6和pIM13。丙酮丁醇梭菌和艱難梭菌在轉化過程中對復制子的偏好并不顯著（Table 3）。對獲得的轉化子進行穩(wěn)定性測試，發(fā)現(xiàn)丙酮丁醇梭菌在pBP1復制子體系下，穩(wěn)定性高達99.4 ，但在pCB102復制子體系下穩(wěn)定性只有76.5（Table 4）。該文獻的報道，有利于后續(xù)梭菌轉化實驗中確定篩選抗性和相應的復制子（圖片數(shù)據(jù)來源于文獻）^[4]。2011年，Yu等人在Heap的研究基礎上，將四種只存在復制子差異的質粒從大腸桿菌中通過結合轉移的方式轉到酪丁酸梭菌（Clostridium tyrobutyricum）中，發(fā)現(xiàn)轉化效率從110^-7-3.310^-6，呈現(xiàn)顯著性差異，pBP1復制子在酪丁酸梭菌中的轉化效率和穩(wěn)定性均是更好^[5]。因此，選擇合適的復制子在梭菌的遺傳轉化研究上具有重要意義。

綜上所述：在梭菌的遺傳轉化上，提高對不同梭菌所需復制子和篩選抗性的關注，確定合適的復制子和篩選抗性，有利于獲得高轉化效率和高穩(wěn)定性的轉化子，用于后續(xù)的實驗研究。本公司目前已成功改造可以在大腸桿菌和梭菌中同時具有復制功能，帶有pCD6或pBP1復制子的質粒，達到利用結合轉移方式進行梭菌改造的基礎條件。同時我們擁有成熟的質粒改造體系，可以針對不同梭菌進行特異的抗性基因選擇，達到高效改造梭菌的目的。

銳志魔方生物具有多年的梭菌培養(yǎng)及基因改造經(jīng)驗，目前保存及培養(yǎng)以下菌株：

（1）     ATCC 29065 Clostridium leptum. 柔嫩梭菌

（2）     ATCC BAA-442 Clostridium sp

（3）     ATCC TSD-25 Clostridium sp:Strain:KNHIs219

（4）     ATCC TSD-34 Clostridium sp:Strain:ASB410

（5）     DSM 10702 Clostridium butyricum 丁酸梭菌

銳志魔方生物可為用戶提供以下實驗定制服務：         

（1）     承接各類梭菌分離培養(yǎng)實驗；                  

（2）     承接梭菌過表達株構建服務；                    

（3）     承接梭菌敲除株構建服務；                      

（4）     承接梭菌轉座子突變體文庫構建、篩選。             

參考文獻：

[1]Charubin K, Bennett RK, Fast AG, Papoutsakis ET. Engineering Clostridium organisms as microbial cell-factories: challenges & opportunities[J]. Metab Eng. 2018;50:173-191. 

[2]Minton NP, Ehsaan M, Humphreys CM, Little GT, Baker J, Henstra AM, Liew F, Kelly ML, Sheng L, Schwarz K, Zhang Y. A roadmap for gene system development in Clostridium[J]. Anaerobe. 2016;41:104-112. 

[3]Nogle R, Nagaraju S, Utturkar SM, Giannone RJ, Reynoso V, Leang C, Hettich RL, Mitchell WP, Simpson SD, Jewett MC, K?pke M, Brown SD. Clostridium autoethanogenum isopropanol production via native plasmid pCA replicon[J]. Front Bioeng Biotechnol. 2022;10:932363. 

 [4]Heap JT, Pennington OJ, Cartman ST, Minton NP. A modular system for Clostridium shuttle plasmids[J]. J Microbiol Methods. 2009;78(1):79-85. 

[5]Yu M, Du Y, Jiang W, Chang WL, Yang ST, Tang IC. Effects of different replicons in conjugative plasmids on transformation efficiency, plasmid stability, gene expression and n-butanol biosynthesis in Clostridium tyrobutyricum[J]. Appl Microbiol Biotechnol. 2012 ;93(2):881-9.