探針合成 基因編輯

【星森林生物】探針是一小段單鏈DNA或者RNA片段（大約是20到500 bp），用于檢測(cè)與其互補(bǔ)的核酸序列。雙鏈DNA加熱 變性成為單鏈，隨后用放射性同位素（通常用磷-32）、螢光染料或者酶（如辣根過(guò)氧化物酶）標(biāo)記成為探針。

實(shí)驗(yàn)材料 基因

試劑、試 劑盒 轉(zhuǎn)錄緩沖液 DTT RNA酶抑制劑 CTP ATP S-UTP 乙酸銨 乙醇

儀器、耗 材 水溶鍋 離心機(jī) 培養(yǎng)箱 烘箱

實(shí)驗(yàn)步驟

1. 在一個(gè)含SP6、T3或T7啟動(dòng)子的載體中，插入目的基因。在編碼序列下游酶切使質(zhì)粒呈線性。DNA以酚/氯0 仿抽提，乙醇沉淀，70%乙醇洗后晾干。以無(wú)菌水重溶沉淀至1 μg/μl。

2. 室溫配罝如下反應(yīng)混合液（總體積20 μl）：

（1）4.0 μl 5×轉(zhuǎn)錄緩沖液

（2）0.2 μl 1 mol/l DTT

（3）60 U RNA酶抑制劑

（4）1.0 μl 三種10 mmol/l NTP中的每一種

（5）1.0 μl 1 μg/μl 酶切DNA

（6）10.0 μl ［35S］UTP

（7）16 U SP6或T7 RNA聚合酶

（8）37℃溫育30 min，再加16 U聚合酶并于37 ℃溫育40 min。

3. 在反應(yīng)混合液中加入：60 U RNA酶抑制劑，20 μl 10 mg/ml 的載體RNA和1.0 μl 酶1，于37℃溫育10 min 以 除去摸板。

4. 往反應(yīng)混合液加入以下液體：0.8 μl 1 mol/l DTT、63 μl 無(wú)菌水和10 μl 3 mol/l 乙酸鈉，取出1 μl 測(cè)定其 cpm/ μl 值。

5. 加36.4 μl 7.5 mol/l的乙酸銨于反應(yīng)混合液（終濃度2 mol/l）加50~100 μg tRNA載體和272 μl 冷無(wú)水乙醇，置 干冰上沉淀10 min，以冷70%乙醇洗沉淀，晾干，需要的話可重復(fù)此步。以100 μl 10 mmol/l DTT重溶DNA沉淀。 6. 確定其 cpm/μl 值，并計(jì)算摻入百分比，核糖核酸探針應(yīng)于2~3天內(nèi)使用。 （70%到90%的標(biāo)記摻入，結(jié)果可 得70~90 ng 標(biāo)記的RNA）。

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