邁瑞動物醫(yī)療免疫分析儀

免疫檢測是利用抗原和抗體之間的特異性親和反應(yīng)來檢測和分析免疫蛋白、受體等生物分子的一種高靈敏度、高選擇性的方法。免疫學(xué)檢測技術(shù)能夠用于免疫疾病的診斷、療效評價(jià)及發(fā)病機(jī)制的研究，如對傳染病、免疫增殖性疾病、免疫缺損病、超敏反應(yīng)、自身免疫病、腫瘤標(biāo)志物等的免疫學(xué)檢測，具有廣泛的用途。

免疫反應(yīng)

抗原和抗體結(jié)合發(fā)生的免疫反應(yīng)具有親和性和特異性，該反應(yīng)不是化學(xué)反應(yīng)，而是非共價(jià)鍵的相互作用，主要包括疏水力、靜電引力、范德瓦耳斯力和氫鍵作用力，這些力的相互作用發(fā)生在側(cè)鏈或多肽鏈主干之間。

疏水力：抗原和抗體分子側(cè)鏈上的某些氨基酸是疏水性膠體，在水溶液中不會與水分子形成氫鍵，當(dāng)抗原決定簇靠近抗體活性結(jié)合位點(diǎn)時(shí)，疏水性氨基酸可排斥水分子形成疏水力，促進(jìn)二者之間的結(jié)合。

靜電引力：抗原決定簇和抗體分子結(jié)構(gòu)中都含有氨基端（帶正電荷）和羧基端（帶負(fù)電荷)，帶有相反電荷的基團(tuán)之間的靜電引力作用促使抗原和抗體相互結(jié)合。

范德瓦耳斯力：分子與分子之間的作用力，其作用效果主要取決于分子的空間構(gòu)型。

氫健作用力：指在具有親水基團(tuán)（如羥基、氨基、羧基）的抗體與相對應(yīng)的抗原相互接近時(shí)形成相對微弱和可逆的氫鍵橋梁，促進(jìn)抗原和抗體的結(jié)合，該作用力比范德瓦耳斯力的結(jié)合力強(qiáng)且更具有特異性。

抗原和抗體的結(jié)合遵循可逆生物大分子相互作用的熱動力學(xué)基本原理，平衡方程為：

式中，K為平衡常數(shù)，是反映抗原與抗體結(jié)合能力的指數(shù)，又常稱為親和常數(shù)，范圍為10^6~10^12L/mol；k1為正反應(yīng)速率常數(shù)：k2為負(fù)反應(yīng)速率常數(shù)；[Ab-Ag]為抗體-抗原結(jié)合物的摩爾濃度；[Ab]和[Ag]分別為游離抗體或抗原的結(jié)合位點(diǎn)的摩爾濃度。

當(dāng)抗原和抗體之間的親和力較強(qiáng)時(shí)，形成的抗原抗體結(jié)合物的結(jié)合牢固，不易解離；反之，結(jié)合物較易解離。雖然抗體和抗原間的免疫反應(yīng)是可逆的，但是在無外界因素的作用下，抗原-抗體結(jié)合物的自發(fā)解離通常非常緩慢，在含有表面活性劑的高濃度無機(jī)鹽溶液中可以加速這一解離過程。二

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 免疫分析是利用抗原與抗體之間高特異性的反應(yīng)（即免疫反應(yīng)）實(shí)現(xiàn)對抗體、抗原或相關(guān)物質(zhì)進(jìn)行檢測的方法。免疫分析方法分為競爭法和非競爭法，其中，競爭法包括直接競爭法和間接競爭法，非競爭法包括雙抗體夾心法及抗原和抗體直接結(jié)合法。

1、間接競爭法

間接競爭法主要是針對半抗原的檢測，因?yàn)槌Ｒ?guī)的基于標(biāo)記的免疫分析方法不適合檢測小分子物質(zhì)。該方法通常將抗原與蛋白質(zhì)（如牛血清蛋白）的結(jié)合物固定在固相表面，待測液中游離的抗原與被固定的抗原競爭結(jié)合游離的過量抗體，移去溶液中的抗原-抗體結(jié)合物，標(biāo)記二抗再與固相表面的抗體（已和被固定的抗原結(jié)合)結(jié)合。標(biāo)記物可以是酶、熒光或其他用于信號放大的物質(zhì)。 

圖片來源：IVD分享庫，Bin仔繪制

當(dāng)樣品中游離抗原的濃度較高時(shí)，與固相載體表面固定的抗原結(jié)合的抗體就越少，相應(yīng)地與之結(jié)合的標(biāo)記二抗就越少，標(biāo)記物產(chǎn)生的響應(yīng)信號（如電流）就越小，由此建立響應(yīng)信號與目標(biāo)抗原濃度之間的關(guān)系。該方法中一個(gè)抗體分子能同時(shí)結(jié)合多個(gè)二抗分子，使信號放大效果大大增強(qiáng)，提高檢測的靈敏度。該方法包含的主要步驟包括抗原抗體溫育、清洗、二抗溫育、信號檢測。

2、直接競爭法

直接競爭法既可以基于抗原（或抗原與蛋白質(zhì)的結(jié)合物）的固定，也可以基于抗體的固定。在基于抗原的固定方式中，游離的抗原與被固定的抗原競爭結(jié)合標(biāo)記抗體，經(jīng)過清洗步驟后檢測抗體標(biāo)記物所引起的響應(yīng)信號的變化。與間接競爭免疫法相比，該方法對抗體進(jìn)行標(biāo)記，減少了使用標(biāo)記二抗結(jié)合的步驟，但同時(shí)，標(biāo)記抗體的成本較高，且不如標(biāo)記二抗的信號放大效果強(qiáng)。） 

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同理，在基于抗體固定的方式中，游離的抗原和標(biāo)記抗原競爭結(jié)合被固定的抗體，經(jīng)過清洗步驟除去未結(jié)合的標(biāo)記抗原。這種方法包含溫育、清洗、信號檢測三個(gè)主要步驟。該方法存在的問題在于，當(dāng)目標(biāo)抗原濃度較低時(shí)，參與競爭的標(biāo)記抗原引起的信號響應(yīng)相對很大，待測信號的變化很小，使得檢測的靈敏度不高；另外，該方法中使用的標(biāo)記物應(yīng)避免對游離抗原親和性的影響。

3、雙抗體夾心法

雙抗體夾心法是一種非競爭方法，需要一抗和二抗兩種抗體。二抗只能與相應(yīng)的抗原發(fā)生特異性結(jié)合，不能與一抗結(jié)合。樣品中的抗原與固定在固相表面的抗體（即一抗）結(jié)合形成抗原-抗體結(jié)合物，經(jīng)清洗后，標(biāo)記二抗與抗原結(jié)合，形成“第一抗體-抗原-第二抗體”的雙抗夾心結(jié)構(gòu)，檢測標(biāo)記物產(chǎn)生的響應(yīng)信號。

圖片來源：IVD分享庫，Bin仔繪制

與競爭免疫分析模式相比，該方法需要固相抗體與標(biāo)記二抗共同對目標(biāo)抗原進(jìn)行特異性識別，減少了非特異性結(jié)合帶來的干擾，因此該方法的特異性和靈敏度更高，檢測下限更低。該方法一般適用于檢測生物大分子，小分子抗原由于沒有足夠的結(jié)合位點(diǎn)同時(shí)結(jié)合一抗和二抗，不適合采用該方法。

4、抗原和抗體直接結(jié)合法

直接結(jié)合的非競爭免疫分析方法將抗體或抗原固定在固相表面，待測抗原或抗體被捕獲后引起響應(yīng)信號的變化。該方法需要考慮非特異性吸附和背景干擾等問題。

直接結(jié)合法示意圖