無血清細(xì)胞凍存液試劑：Cell Reservoir One,Vitrify

 玻璃化冷凍法可以有效保證細(xì)胞在解凍后具有較高的存活率，因而已成為標(biāo)準(zhǔn)慢程序冷凍方法的重要替代方法。然而，玻璃化需要超快速的冷凍程序，從制造細(xì)胞懸浮液到冷凍在液氮中通常不超過15秒。

Cell Reservoir One,Vitrify是一種新型的用于玻璃化的無血清細(xì)胞培養(yǎng)冷凍培養(yǎng)基，其主要成分為從蠶繭中分離得到的水溶性糖蛋白絲膠蛋白。即使采用更長時間的冷凍方案，Cell Reservoir One,Vitrify也能使靈長類細(xì)胞(如猴胚胎干細(xì)胞和人類IPS細(xì)胞)具有很高的存活率;從細(xì)胞收集到在液氮中冷凍長達(dá)60秒。

  無血清細(xì)胞凍存液試劑 產(chǎn)品特點(diǎn)：

1. 經(jīng)過較長時間的操作（長達(dá)60秒），仍可以保持細(xì)胞高存活率。

2. 對細(xì)胞低毒性，不含有DMSO和乙酰胺

3. 可以用于靈長類胚胎干細(xì)胞和人IPS細(xì)胞

 應(yīng)用實(shí)例1：人誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞的存活率比較（201B7 細(xì)胞系*）

*Takahashi, K. et al. Cell, 2007 Nov 30;131(5):861-872

冷凍流程：60秒

人IPS細(xì)胞在Cell Reservoir One,Vitrify和DAP213中冷凍保存2周以上。

細(xì)胞解凍后4天用堿性磷酸酶檢測細(xì)胞存活率。Cell Reservoir One,Vitrify細(xì)胞存活率高，而DAP213大部分細(xì)胞死亡。

冷凍流程：15秒

人IPS細(xì)胞在Cell Reservoir One,Vitrify、DAP213和A公司產(chǎn)品中冷凍保存2周以上。

細(xì)胞解凍后4天用堿性磷酸酶檢測存活率。Cell Reservoir One,Vitrify保存的細(xì)胞表現(xiàn)出的生存能力。

結(jié)論：Cell Reservoir One (Vitrify) 在經(jīng)過 15 或 60 秒冷凍時間后都顯示較高的細(xì)胞存活率。在 60 秒冷凍操作的情況下，Cell Reservoir One (Vitrify) 的細(xì)胞存活率顯著高于其它試劑產(chǎn)品。

應(yīng)用實(shí)例2：靈長類干細(xì)胞恢復(fù)率的比較。

應(yīng)用實(shí)例3：人iPS細(xì)胞(253G1)與競爭對手復(fù)蘇率的比較

人iPS細(xì)胞用不同公司的冷凍培養(yǎng)基中冷凍15秒，冷凍保存2小時。

解凍后4天評價復(fù)蘇率。Cell Reservoir One (Vitrify) 全部回收率

應(yīng)用實(shí)例4：人iPS細(xì)胞（253G1）復(fù)蘇率的比較及未分化狀態(tài)的檢測

與DAP213相比，Cell Reservoir One (Vitrify) 具有更高的復(fù)蘇率。凍結(jié)操作的時間（15秒

或60秒）不影響細(xì)胞的復(fù)蘇率，以及未分化標(biāo)記基因的表達(dá)也可以證明。

操作步驟：

細(xì)胞凍存 

1. 在干凈的工作臺附近準(zhǔn)備鑷子和液氮。
2. 分離靈長類動物的ES/iPS細(xì)胞（0.25%胰蛋白酶/膠原酶IV溶液），并小心收集細(xì)胞。
3. 將細(xì)胞收集到離心管中，離心并盡可能多地去除上清。Cell Reservoir One (Vitrify)的濃度被上清液稀釋可能降低細(xì)胞活性。
4. 加入200ul的Cell Reservoir One (Vitrify)，小心用移液器混合4-5次，以分散細(xì)胞。將細(xì)胞迅速轉(zhuǎn)移到凍存管中。
5. 將凍存管2/3浸入到液氮中10秒，然后*浸沒。為了增加成功率，4-5步驟需要在60秒內(nèi)完成。
6. 將凍存管轉(zhuǎn)移到液氮培養(yǎng)罐保存。

細(xì)胞復(fù)蘇

1. 在離心管中，37℃水浴預(yù)熱10ml細(xì)胞培養(yǎng)基。
2. 從液氮罐中取出裝有冷凍細(xì)胞的低溫保存管，轉(zhuǎn)移到干凈的工作臺上，并保證其浸泡在液氮中。
3. 從液氮中取出管子。打開蓋子，把管里的液氮倒置丟棄
4. 在凍存管中加入超過800ul的預(yù)熱細(xì)胞培養(yǎng)基，并用移液槍吹打幾次，使細(xì)胞迅速解凍。根據(jù)凍存管大小加入的培養(yǎng)基越多細(xì)胞解凍越快。
5. 將細(xì)胞懸浮液轉(zhuǎn)移到步驟1的離心管中。3-5步驟操作越快越好
6. 用細(xì)胞培養(yǎng)基清洗凍存管，將培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到步驟1的離心管中。
7. 離心收集細(xì)胞，轉(zhuǎn)移到新鮮培養(yǎng)基中培養(yǎng)。盡可能多的去除上清。

注意：

1) 使用前先對目標(biāo)細(xì)胞進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)。

2) NACALAI不承擔(dān)因使用本產(chǎn)品而產(chǎn)生的任何損害或損失的責(zé)任。

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