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BioRad酶標儀熒光分析技術是一種強大的分析手段，廣泛地應用在臨床檢驗、生物學研究、農(nóng)業(yè)科學、食品和環(huán)境科學中，是多功能酶標儀的重要應用，如TECAN(M1000、M200等)，Thmeral(Varioskan Flash)，Bio-tek（Synergy 4等），MD（M2、M5）都可以應用于熒光檢測。

BioRad酶標儀概述；
室溫下，大多數(shù)分子處于基態(tài)的低振動能級，處于基態(tài)的分子吸收能量（光能、化學能、電能或熱能）后躍遷至激發(fā)態(tài)，激發(fā)態(tài)不穩(wěn)定，將很快衰變到基態(tài)，以光的形式放出能量，這種現(xiàn)象稱為“發(fā)光現(xiàn)象”。分子發(fā)光包括熒光，磷光，化學發(fā)光，生物發(fā)光等。受到光照時發(fā)光，光照切斷時發(fā)光立即消失的叫熒光，光照切斷時，發(fā)光逐漸變弱以致消失的叫磷光，吸收化學反應的化學能量而發(fā)光叫化學發(fā)光，由生物能轉變?yōu)楣廨椛涞姆Q作生物發(fā)光。
由于發(fā)光物質不同熒光有分子熒光和原子熒光之分，分子熒光為帶光譜，原子熒光為線光譜，通常所說的熒光為分子熒光。通過測定所發(fā)射熒光的特性和強度，可以對物質進行定性、定量分析。

BioRad酶標儀熒光檢測技術；
1熒光強度
熒光強度與熒光物質的濃度成正比，這是熒光分析法是量分析的依據(jù)。在生物學上的應用非常廣泛，可以進行生物大分子定量，酶活性分析，熒光免疫分析，細胞學分析（細胞增殖，細胞毒理，細胞吸附等）和分子間相互作用。

1.1細胞凋亡檢測
Caspase家族在介導細胞凋亡的過程中起著非常重要的作用，其中Caspase-3為關鍵的執(zhí)行分子，它在凋亡信號傳導的許多途徑中發(fā)揮功能。Caspase-3正常以酶原（32KD）的形式存在于胞漿中，在凋亡的早期階段，它被激活，活化的Caspase-3由兩個大亞基（17KD）和兩個小 亞基（12KD）組成，裂解相應的胞漿胞核底物，終導致細胞凋亡。但在細胞凋亡的晚期和死亡細胞，caspase-3的活性明顯下降。
設計出熒光物質偶聯(lián)的短肽Z-DEVD-AMC。在共價偶聯(lián)時，AMC不能被激發(fā)熒光，短肽被水解后釋放出AMC，自由的AMC才能被激發(fā)發(fā)射熒光。根據(jù)釋放的AMC熒光強度的大小，可以測定 caspase-3的活性，從而反映Caspase-3被活化的程度。

1.2細胞毒性的檢測
體外細胞毒性研究對于檢測新的生物來源或人工合成的細胞毒素以及例行的臨床相關的檢測都有著重要的意義。細胞膜非滲透性的核染料 Propidium iodide能穿透損傷的細胞膜，熒光密度越高反映出其受損細胞越多。

1.3鈣流檢測
Fura-2、indo-1、Quin-2是Ca2+熒光指示劑，可以靈敏地反映細胞內鈣離子濃度的變化，當結合鈣離子時，激發(fā)波長會發(fā)生改變，發(fā)射熒光的強度和結合的Ca2+濃度有著定量的關系。

2.熒光偏振(FP)
1926年Perrin首先描述了熒光偏振理論，溶液中的熒光分子在受到偏振光照射時，可吸收并釋放出相應的偏振熒光，如果在激發(fā)時熒光物質處于靜止狀態(tài)，發(fā)射光將保持原有激發(fā)光的偏振性，如果其處于運動狀態(tài)，發(fā)射光電偏振偏振平面將不同于原有激發(fā)光的偏振特性，這就是熒光偏振現(xiàn)象，熒光分子與其它因子的相互作用，例如相互結合或排斥；其所處環(huán)境的性質，例如溶液的粘度、溫度等，這些因素都有可能對這個熒光因子受激發(fā)后發(fā)出的發(fā)射光的發(fā)射平面產(chǎn)生影響。因此以熒光偏振為基礎發(fā)展的技術可用來研究生命科學中分子之間的相互作用，如受體配體結合分析，DNA－蛋白質結合分析，SNP分析，酶活性分析。

熒光偏振分析所需的樣品量少，靈敏度高，可達亞納摩爾級范圍，重復性好，操作簡便，也更為安全可靠，不會在實驗過程中生成有害的放射性**，此外熒光偏振是真正均相的，允許實時檢測（動力學檢測），對于濃度變化不敏感，是均相檢測形式（中間不含洗滌步驟）的解決方案。

酶標儀實際上就是一臺變相光電比色計或分光光度計，其基本工作原理與主要結構和光電比色計基本相同. 圖示是一種單通道自動進樣的酶標儀工作原理圖.光源燈發(fā)出的光波經(jīng)過濾光片或單色器變成一束單色光，進入塑料微孔極中的待測標本.該單色光一部分被標本吸收，另一部分則透過標本照射到光電檢測器上，光電檢測器將這一待測標本不同而強弱不同的光信號轉換成相應的電信號.電信號經(jīng)前置放大，對數(shù)放大，模數(shù)轉換等信號處理后送入微處理器進行數(shù)據(jù)處理和計算，后由顯示器和打印機顯示結果. 微處理機還通過控制電路控制機械驅動機構X方向和Y方向的運動來移動微孔板，從而實現(xiàn)自動進樣檢測過程.而另一些酶標儀則是采用手工移動微孔板進行檢測，因此省去了X,Y方向的機械驅動機構和控制電路，從而使儀器更小巧，結構也更簡單.

Bio-Rad酶標儀：即酶聯(lián)免疫檢測儀（ELISA Reader）是酶聯(lián)免疫吸附試驗的儀器。可簡單地分為半自動和全自動2大類，但其工作原理基本上都是一致的，其核心都是一個比色計，即用比色法來分析抗原或抗體的含量。ELISA測定一般要求測試液的終體積在250ul以下，用一般光電比色計無法完成測試，因此對酶標儀中的光電比色計有特殊要求。

Bio-Rad酶標法的基本原理是將抗原或抗體與酶用膠聯(lián)劑結合為酶標抗原或抗體，此酶標抗原或抗體可與固相載體上或組織內相應抗原或抗體發(fā)生特異反應，并牢固地結合形成仍保持活性的免疫復合物。當加入相應底物時，底物被酶催化而呈現(xiàn)出相應反應顏色。顏色深淺與相應抗原或抗體含量成正比。由于此技術是建立在抗原-抗體反應和酶的高效催化作用的基礎上，因此，具有高度的靈敏性和特異性，是一種極富生命力的免疫學試驗技術。

Bio-Rad酶標儀所用的單色光既可通過相干濾光片來獲得，也可用分光光度計相同的單色器來得到。在使用濾光片作濾波裝置時與普通比色計一樣，濾光片即可放在微孔板的前面，也可放在微孔板的后面，其效果是相同的。光源燈發(fā)出的光經(jīng)聚光鏡，光欄后到達反射鏡，經(jīng)反射鏡作90o反射后垂直通過比色溶液，然后再經(jīng)濾光片送到光電管。

Bio-Rad酶標儀和普通的光電比色計有以下幾點差異：
(l)盛裝待測比色液的容器不再使用比色皿，而是使用塑料微孔板。微孔板常用透明的聚乙烯材料制成，對抗原抗體有較強的吸附作用，故用它作為固相載體。
(2)由于盛樣本的塑料微孔板是多排多孔的，光線只能垂直穿過，因此酶標儀的光來都是垂直通過待測溶液和微孔板的，光束既可是從上到下，也可以是從下到上穿過比色液。
(3)酶標儀通常不僅用A，有時也使用光密度OD來表示吸光度。

Bio-Rad酶標儀可分為單通道和多通道2種類型，單通道又有自動和手動2種之分。自動型的儀器有X，Y方向的機械驅動機構，可將微孔板L的小孔一個個依次送入光束下面測試，手動型則靠手工移動微孔板來進行測量。在單通道酶標儀的基礎上又發(fā)展了多通道酶標僅，此類酶標僅一般都是自動化型的。它設有多個光束和多個光電檢測器，如12個通道的儀器設有12條光束或12個光，12個檢測器和12個放大器，在X方向的機械驅動裝置的作用下，樣品12個為一排被檢測。多通道酶標儀的檢測速度快，但其結構較復雜價格也較高。

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