細(xì)胞水平氧化應(yīng)激標(biāo)記物丙.烯醛的檢測(cè)試劑

AcroleinRED

本試劑能與劇毒的不飽和醛——丙.烯醛進(jìn)行特異性反應(yīng)，并通過紅色熒光使其可視化。它不和其他不飽和醛或脂質(zhì)代謝物等進(jìn)行反應(yīng)，因此可以從活細(xì)胞中檢測(cè)出內(nèi)源性丙.烯醛或由外部刺激而過量產(chǎn)生的丙.烯醛，并且可進(jìn)行相對(duì)定量。

※本產(chǎn)品基于理化學(xué)研究所開拓研究本部田中生體機(jī)能合成化學(xué)實(shí)驗(yàn)室的研究成果商品化而成。

※ 本產(chǎn)品僅供研究用。請(qǐng)勿用于研究以外的其他用途。

◆丙.烯醛是什么？

丙.烯醛（Acrolein；2-propenal）是具有極其簡(jiǎn)單結(jié)構(gòu)的α，β不飽和醛。因其化學(xué)活性高，近年來作為氧化應(yīng)激標(biāo)記備受矚目。丙.烯醛的產(chǎn)生源十分廣泛，具體可分為環(huán)境因素和生理因素。已知的環(huán)境因素有：烹飪食品時(shí)可能產(chǎn)生丙.烯醛（特別是油炸肉或魚，烘烤或燒焦時(shí)等等），以及飲酒、香煙中的煙霧、排氣導(dǎo)致丙.烯醛的生成（燃燒有機(jī)物）等。另外，在生理因素方面，有報(bào)道稱丙.烯醛在生物體內(nèi)經(jīng)常作為代謝副產(chǎn)物被合成，如在脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，蘇氨酸和蛋氨酸的酶依賴性代謝反應(yīng)，多胺氧化反應(yīng)以及由于細(xì)胞暴露而產(chǎn)生的氧化應(yīng)激反應(yīng)。

由于丙.烯醛的化學(xué)反應(yīng)活性非常高，它能與生物體內(nèi)各種親核基團(tuán)結(jié)合（蛋白質(zhì)、核酸和脂質(zhì)等），從而破壞其功能，因此它作為一種具有強(qiáng)毒性的氧化應(yīng)激標(biāo)記物開始為人們認(rèn)知。近年研究表明，丙.烯醛的毒性高于有名的氧化應(yīng)激標(biāo)記物，活性氧（Reactive Oxidative species；ROS）。它不僅在基礎(chǔ)生物學(xué)，在制藥、環(huán)境科學(xué)、食品產(chǎn)業(yè)、健康產(chǎn)業(yè)等廣泛地生命科學(xué)領(lǐng)域中也備受矚目。然而，由于丙.烯醛結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單且反應(yīng)活性高，導(dǎo)致其檢測(cè)困難且難以對(duì)它進(jìn)行詳細(xì)分析。

丙.烯醛的結(jié)構(gòu)式

■　傳統(tǒng)的丙.烯醛檢測(cè)方式

在傳統(tǒng)法中，想要檢測(cè)丙.烯醛十分困難，通常會(huì)利用丙.烯醛的α，β-不飽和醛結(jié)構(gòu)的化學(xué)反應(yīng)進(jìn)行檢測(cè)。以下列舉兩種具有代表性的方法。

1）檢測(cè)FDP

丙.烯醛能與生物體內(nèi)蛋白的胺緩慢反應(yīng)，生成3-甲?；?3,4-脫氫哌啶（FDP）。通過使用能識(shí)別FDP的抗體，間接檢測(cè)并定量丙.烯醛的方法得到廣泛應(yīng)用。然而，有研究人員提出了該方法的缺點(diǎn)：①畢竟FDP只是眾多丙.烯醛反應(yīng)物中的一種，憑借抗FDP抗體對(duì)丙.烯醛的評(píng)價(jià)并不充分；②由于 FDP的生成十分緩慢，無法在高靈敏度下觀察丙.烯醛的生成。另外，由于使用抗體，因此不適用于活細(xì)胞實(shí)驗(yàn)（見上圖方法一）。

2）利用HPLC檢測(cè)

通過使用3-氨基丙醇與丙.烯醛發(fā)生選擇性的熒光反應(yīng)，然后使用HPLC熒光分析對(duì)具有熒光性的生成物7-羥基喹啉進(jìn)行定量。但是由于丙.烯醛的高活性和揮發(fā)性，無法輕易將其分離，生成物的熒光靈敏度低、通量低，且無法避免細(xì)胞破裂，無法檢測(cè)活細(xì)胞的丙.烯醛含量（見上圖方法二）。

◆AcroleinRED的原理

AcroleinRED是利用了理化學(xué)研究所田中克典主任研究員等人所發(fā)現(xiàn)的苯基疊氮化合物與丙.烯醛發(fā)生特異性環(huán)化反應(yīng)時(shí)所用到的試劑。

■　苯基疊氮化合物丙.烯醛的特異性反應(yīng)

苯基疊氮化合物與丙.烯醛特異性地且迅速地發(fā)生反應(yīng)，生成環(huán)狀產(chǎn)物4-甲酰基1,2,3-三唑啉。4-甲酰基1,2,3-三唑啉能與附近的生物分子非特異性結(jié)合并形成共價(jià)鍵。

■　利用AcroleinRED檢測(cè)丙.烯醛的原理

利用AcroleinRED檢測(cè)丙.烯醛的原理可以分為細(xì)胞內(nèi)外兩條途徑。

①檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)丙.烯醛

AcroleinRED擁有膜通透性，能夠穿透細(xì)胞膜，在細(xì)胞內(nèi)與丙.烯醛反應(yīng)并形成4-甲酰基1,2,3-三唑啉。

②檢測(cè)釋放到細(xì)胞外的丙.烯醛

細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化反應(yīng)所產(chǎn)生的丙.烯醛被釋放到細(xì)胞外。丙.烯醛與細(xì)胞外的AcroleinRED迅速反應(yīng)，反應(yīng)生成物4-甲?；?,2,3-三唑啉通過胞吞進(jìn)入到細(xì)胞中。

無論是①，②哪條途徑的反應(yīng)生成物4-甲?；?,2,3-三唑啉，都會(huì)隨機(jī)地與生物分子（蛋白等）反應(yīng)，后在細(xì)胞內(nèi)將細(xì)胞染色。

※    請(qǐng)注意，本試劑不能用于局部觀察。由于丙.烯醛與試劑的反應(yīng)生成物以及附加在生物分子的狀態(tài)都會(huì)通過熒光

※    信號(hào)被檢測(cè)出，因此并不能使丙.烯醛局部可視化。

◆特點(diǎn)

●　AcroleinRED是利用了苯基疊氮化合物與丙.烯醛特異性且迅速發(fā)生反應(yīng)這一原理的試劑。通過使用TAMRA染料

●　標(biāo)記從細(xì)胞中產(chǎn)生的丙.烯醛，使丙.烯醛可視化。

●　可使用羅丹明濾光片組件觀察（激發(fā)/熒光波長(zhǎng)：560 nm/585 nm）。

●　不與其他不飽和醛（巴豆醛，反式2-辛烯醛，異丁烯醛）、苯乙烯反應(yīng)。

●　無需前處理，簡(jiǎn)單地操作即可檢測(cè)。

●　與現(xiàn)有丙.烯醛定量法相比，靈敏度高。（丙.烯醛濃度的檢測(cè)上限：100 nM）

●　可根據(jù)熒光強(qiáng)度相對(duì)定量丙.烯醛。

◆原著論文

●　A. R. Pradipta, M. Taichi, I. Nakase, E. Saigitbatalova, A. Kurbangalieva, S. Kitazume, N. Taniguchi,

●　K. Tanaka, ACS Sens., 1, 623～632 (2016).

●　Uncatalyzed Click Reaction between Phenyl Azides and Acrolein: 4-Formyl-1,2,3-Triazolines as

●　“Clicked” Markers for Visualizations of Extracellular Acrolein Released from Oxidatively Stressed

●　Cells.

●　T. Tanei, A. R. Pradipta, K. Morimoto, M. Fujii, M. Arata, A. Ito, M. Yoshida, E. Saigitbatalova, A.

●　Kurbangalieva, J. Ikeda, E. Morii, S. Noguchi, and K. Tanaka, Adv. Sci., 1801479 (2018)

●　Cascade reaction in human live tissue allows clinically applicable diagnosis of breast cancer

●　morphology.

◆應(yīng)用

●　穩(wěn)態(tài)下對(duì)丙.烯醛產(chǎn)生量進(jìn)行相對(duì)定量

●　對(duì)因外部刺激（藥劑處理等）導(dǎo)致丙.烯醛產(chǎn)生量變動(dòng)進(jìn)行相對(duì)定量

※    不可用于丙.烯醛的局部觀察。詳情請(qǐng)瀏覽本文“原理”部分。

◆操作方法概要

1.　使用新鮮的培養(yǎng)基制備AcroleinRED溶液（終濃度10~30 μM）。

1.　※ 終濃度可能會(huì)因?yàn)榧?xì)胞種類不同而有所差別，建議根據(jù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)化。

2.　去除培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)基，用PBS清洗2次。

3.　添加含有AcroleinRED的培養(yǎng)基。

4.　培養(yǎng)30分鐘~1小時(shí)。

1.　※ 注意：熒光信號(hào)會(huì)隨處理時(shí)間的增加而積累。請(qǐng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)選擇理想的處理時(shí)長(zhǎng)。

5.　用PBS清洗細(xì)胞3次，更換新的培養(yǎng)基。

6.　可以觀察非固定細(xì)胞（活細(xì)胞）及固定細(xì)胞。

◆應(yīng)用實(shí)例

■　驗(yàn)證苯基疊氮化合物的丙.烯醛特異性

■　依賴于氧化應(yīng)激的丙.烯醛的產(chǎn)生量增加

在氧化應(yīng)激模型中，將0~1，000 μM的各濃度的過氧化氫H₂O₂添加至HUVEC細(xì)胞中預(yù)孵育2小時(shí)后，添加AcroleinRED并在30分鐘后進(jìn)行非固定觀察。在未添加H₂O₂時(shí)可觀察到穩(wěn)態(tài)下丙.烯醛的產(chǎn)生量。另外，可以發(fā)現(xiàn)隨著H₂O₂濃度的增加，丙.烯醛的生成量也不斷增加。

■　ROS產(chǎn)生促進(jìn)劑使丙.烯醛產(chǎn)生量增加

使用能促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）產(chǎn)生的物質(zhì)甲萘醌對(duì)細(xì)胞處理0、10、30、60分鐘后，分別使用ROS檢測(cè)試劑以及AcroleinRED進(jìn)行共染色?？捎^察到經(jīng)甲萘醌處理后，細(xì)胞的ROS迅速增加，而丙.烯醛則是緩慢增加。

■　不同細(xì)胞種類所產(chǎn)生的丙.烯醛產(chǎn)生量比較

使用AcroleinRED對(duì)3種正常細(xì)胞以及8種人癌細(xì)胞株進(jìn)行丙.烯醛產(chǎn)生量的相對(duì)比較。結(jié)果表明，與正常細(xì)胞相比，癌細(xì)胞中丙.烯醛的產(chǎn)生量明顯增加。并且發(fā)現(xiàn)每種癌細(xì)胞的丙.烯醛的產(chǎn)生量之間也有差別。

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■　組織中丙.烯醛的可視化

將乳腺癌患者來源乳腺組織（IDC，浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌, DCIS，原位導(dǎo)管癌）以及正常乳腺組織（NBG）提取后立刻以非固定狀態(tài)浸于AcroleinRED（20 μM）/Hochest混合溶液中，靜置5分鐘后染色丙.烯醛和細(xì)胞核，清洗組織后使用熒光顯微鏡觀察。

結(jié)果表明，AcroleinRED處理過的乳腺癌組織（IDC，DCIS）中可以觀察到紅色熒光，但正常乳腺癌組織（NBG）卻基本無法觀察到經(jīng)過AcroleinRED處理的染色。通過這種方法，可以對(duì)非固定狀態(tài)下的提取組織進(jìn)行染色。

◆產(chǎn)品列表