iElisa 沙丁胺醇檢測試劑盒

iElisa 沙丁胺醇檢測試劑盒

1. 概要 沙丁胺醇酶聯(lián)免疫反應(yīng)測試盒利用競爭性酶 聯(lián)免疫反應(yīng)原理，對動物組織，肉類，飼料和尿液 等中沙丁胺醇的殘留進行定量檢測。沙丁胺醇可以 通過改變肌肉/脂肪的比例來達到動物增肥和加快 生長的目的，另外它由于對肌肉有松弛作用而作為 止喘藥和分娩抑制劑應(yīng)用于人類。因此畜產(chǎn)品中過 量的沙丁胺醇會對人類的生命安全造成威脅，它在 食品生產(chǎn)中已被禁用。 2. 原理 測定的基礎(chǔ)是抗原-抗體反應(yīng)。微孔板上包被有 抗抗體。加入沙丁胺醇標準品或樣品、酶標抗原和 抗體后，游離的沙丁胺醇與酶標抗原競爭結(jié)合抗 體，抗體或抗體結(jié)合物與固定在微孔板上的抗抗體 再結(jié)合，沒有結(jié)合的標準品、酶標抗原及抗體被洗 去，加入 TMB 底物顯藍色，加入終止液后顏色由 藍變黃，用酶標儀在 450nm 處檢測，吸光值與樣品 中沙丁胺醇含量成負相關(guān)，與標準曲線比較即可得 出沙丁胺醇的含量。 3. 試劑盒的組成 1) 包被有二抗的96微孔板：1塊（96 孔，12 條×8 孔） 2) 標準品：0 ng/mL 、0.1ng/mL、0.5ng/mL、 2.0ng/mL、5.0ng/mL、20.0 ng/； a) 1 瓶 × 1.0mL 3) 抗體： 1 瓶 × 10mL 4) 酶標抗原： 1 瓶 × 10mL 5) 10×洗滌濃縮液： 1 瓶 × 50mL 6) 10×復(fù)溶濃縮液： 1 瓶 × 16mL 7) 稀釋緩沖液A： 1 瓶 ×50mL 8) 稀釋緩沖液B： 1 瓶 ×50mL 9) 顯色底物： 1 瓶 ×17mL 10) 終止液： 1 瓶 × 7mL 11) 試劑盒說明書: 1 份 4. 需要的儀器、試劑 1）儀器 —酶標儀 450nm（iElisa 全自動酶標儀或相當(dāng)者） —微量移液器：20μL-200μL 單道，100μL-1000μL 單道, 50μL-300μL 八道 —渦旋混合器 —酶標板振蕩器 —多功能旋轉(zhuǎn)振蕩器 —離心機 —氮吹儀 —計時器 —50mL 和 10mL 離心管 —天平：感量 0.01g 2） 試劑 —甲醇 —正己烷 —無水硫酸鈉 —蒸餾水 —鹽酸 —氫氧化鈉 —乙腈 5. 工作溶液的配制 1) 洗滌液的配制： 根據(jù)實驗所需的量用純水將 10 倍洗滌濃縮液稀釋 10 倍后使用。（例如：取 10 mL 濃縮液+90 mL 純水, 可以用于 32 孔的 檢測）。 2) 復(fù)溶液的配制（肌肉、肝臟、腎臟樣品用）：根 據(jù)實驗所需的量用純水將 10 倍復(fù)溶濃縮液稀 釋 10 倍后使用。（例如：取 2mL 濃縮液+18 mL 純水）。 3) 1.0mol/ L 鹽酸提取液的配制（飼料樣品用）: 取 10mL 濃鹽酸，置于 110mL 純水中，混勻。 4) 0.1mol/ L 氫氧化鈉溶液的配制（飼料樣品用）: 取 4.0g NaOH 加純水定容至 100.0mL。 5) 0.2mol/ L 氫氧化鈉溶液的配制（豬毛樣品用）: 取 8.0g NaOH 加純水定容至 100.0mL。 6. 樣品處理 6.1 尿樣 1） 取尿樣，4000r/min 離心 10min； 2） 取上清液 100μL，用 300μL 稀釋緩沖液 A 稀釋， 混勻、取 50μL 用于檢測。 稀釋倍數(shù)：4 6.2 肌肉、肝臟、腎臟： 1) 去除肌肉、肝臟或者腎臟中的脂肪部分；2) 取4.0g均質(zhì)樣品于50mL離心管中，加入8.0mL 乙腈樣品提取液，多功能旋轉(zhuǎn)振蕩器振蕩提取 30 分鐘； 3) 室溫下 4000r/min 離心 10min，移取上清液 4.0mL 到另一試管中，氮吹儀吹干； 4) 用 1.0mL 復(fù)溶液復(fù)溶，向試管中加入 2.0mL 正己烷，渦漩混勻 30 秒，4000r/min 離心 10 分鐘； 5) 取 100μL 下層樣品提取液，用 400μL 稀釋緩沖 液 B 稀釋，混勻、取 50μL 用于檢測。 稀釋倍數(shù)：2.5 6.3 飼料原料 1) 稱取2.0g粉碎樣品于50mL離心管中，加2.0mL 1.0mol/L 鹽酸提取液及 18mL 純水，混合均勻， 用多功能旋轉(zhuǎn)振蕩器振蕩提取 10min。 2) 4000r/min 離心 10min。 3) 取上清加入 0.1mol/L 氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié) pH 到 7.0-8.0。混合后 4000r/min 離心 10min。 4) 取濾液 200µL，用 200µL 稀釋緩沖液 B 稀釋， 混勻、取 50uL 用于檢測。 稀釋倍數(shù)：22 6.4 復(fù)合飼料 1) 稱取 1.0g 粉碎樣品于 50mL 離心管中，加 10mL 甲醇及 5.0g 無水硫酸鈉，多功能旋轉(zhuǎn)振蕩器振 蕩提取 10 分鐘。 2) 4000r/min 離心 10min。 3) 取上清 1.0 mL 于氮吹儀下吹干（50 °C）。 4) 加入 1 mL 水，1.0 mL 正己烷復(fù)溶（渦旋混勻）。 5) 取濾液 200µL，用 200µL 稀釋緩沖液 A 稀釋， 混勻、取 50uL 用于檢測。 稀釋倍數(shù)：20 6.5 豬毛 1) 稱取0.1g粉碎樣品于具塞試管中，加2mL 0.2M 鹽酸提取液，100°C 溫育 10min，多功能旋 轉(zhuǎn)振蕩器振蕩提取 10 分鐘。冷卻至室溫。 2) 將 1mL 提取液轉(zhuǎn)入離心管中，加 10mL 乙酸乙 酯渦旋 30S。 3) 室溫下 3000r/min 離心 5min。 4) 取上清 5.0 mL 于氮吹儀下吹干（40 °C）。 5) 取 500µL 稀釋緩沖液 A 復(fù)溶。 稀釋倍數(shù)：20 7． 酶聯(lián)免疫分析程序 7.1 測定之前注意事項 1) 使用前將所有試劑平衡至室溫（20-25℃）。 2) 使用后迅速將試劑放入 2-8℃冷藏。 3) 在 ELISA 分析中的再現(xiàn)性，很大程度上取決于 洗板的*性，正確的洗板操作是 ELISA 測定 程序中的要點。 4) 所有溫育過程應(yīng)避免陽光直射，并按要求用蓋 板覆蓋住酶標板。 7.2 測定程序 1） 將足夠標準品和樣品所用數(shù)量的孔條插入酶標 板架，標準品和樣品做兩個平行實驗，記錄下 標準和樣品的位置。未使用的酶標板用鋁箔袋 封好置 2-8℃冷藏保存。 2） 吸取50μL標準品和樣品分別加至相應(yīng)的微孔 （雙孔）中，各微孔中加入50μL 酶標抗原，再 各加入50μL抗體，在室溫溫育30min。 3） 倒出孔中的液體，每孔加入250μL 稀釋好的洗 滌液于酶標振蕩器上振蕩30s（或者手工振蕩）， 重復(fù)操作四次，洗完后用力在吸水紙上拍干。 4） 每孔加入150μL顯色底物，室溫避光溫育10min。 5） 每孔加入50μL 終止液。 6） 置于酶標儀中，振蕩混勻，在450nm處測定吸 光度值（OD值），參比波長630nm。（iElisa全自 動酶標儀可以直接讀出、打印濃度值）。 8. 結(jié)果計算 1) 所獲得的每個濃度標準溶液和樣本吸光度值 的平均值（B）除以*個標準（0 標準）的吸 光度值（B0）再乘以 100%，即百分吸光度值。 百分吸光度值（%）＝ B ×100% B0 以沙丁胺醇標準濃度與所獲得的各標準點和 樣品的平均百分吸光度值值做 log-logit（B/B0 ）回 歸。相對應(yīng)每一個樣品的濃度可以從標準曲線上讀 出。 2） 樣品的實際濃度為讀數(shù)結(jié)果乘以相應(yīng)稀釋倍 數(shù)。 3） 如果測定值超出檢測范圍，樣品提取溶液按一 定的比例用稀釋后復(fù)溶液進行稀釋。9. 注意事項 1) 室溫低于20℃或試劑及樣品未回到室溫（20- 25℃）會導(dǎo)致數(shù)值偏低。 2) 在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥過久的情況， 則會出現(xiàn)標準曲線不成線性，重復(fù)性不好的現(xiàn) 象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進行下一步操作。 3) 標準物質(zhì)和顯色液對光敏感，避免直接暴露在 光線下。 4) 混合要均勻，洗板要*（包括加樣品和標準 液的時候都必需充分混合均勻）。 5) 終止液為強酸性物質(zhì)，避免接觸皮膚。 6) 不要使用過了有效期的試劑盒，也不要使用不 同批次的試劑盒，這樣會引起測定誤差。 7) 試劑盒的儲存條件是2-8℃，切勿冷凍。 10. 檢測方法靈敏度、準確度、精密度 1) 試劑盒靈敏度: 0.1ppb。 2) 試劑盒變異系數(shù)：小于 20%。 3) 試劑盒準確度：回收率 70％-120％之間。