禽流感病毒H5/H7(AIV-H5/H7)熒光PCR試劑盒說明書

【產(chǎn)品名稱】

商品名稱：禽流感病毒H5/H7亞型(AIV-H5/H7)?核酸檢測(cè)試劑盒(實(shí)時(shí)熒光-PCR法)

Name ：Avian influenza virus H5/H7 subtype (AIV-H5/H7) nucleic acid detection kit (real-time fluorescence-PCR)

【包裝規(guī)格】48T/盒

【預(yù)期用途】

禽流感是由A型流感病毒所引起的禽類疾病。禽流感病毒H5/H7(AIV-H5/H7)除了感染禽類外，部分亞型也能夠引起人感染或發(fā)病。野生水禽是禽流感病毒的自然宿主，一般對(duì)其不致病，當(dāng)它們傳染給其它物種時(shí)有時(shí)會(huì)造成大的發(fā)病率和死亡率。

本試劑盒適用于檢測(cè)標(biāo)本中的禽流感病毒H5/H7(AIV-H5/H7)，適用于禽流感病毒H5/H7(AIV-H5/H7)?感染的輔助診斷及流行病學(xué)調(diào)查。

【檢驗(yàn)原理】

本試劑盒分別對(duì)禽流感病毒H5/H7(AIV-H5/H7)設(shè)計(jì)特異性的引物和探針，用一步法熒光RT-PCR技術(shù)對(duì)AIV-H5/H7 RNA進(jìn)行體外擴(kuò)增檢測(cè)。

【試劑組成】

注：

1）不同批號(hào)試劑不能混用。

2）試劑盒內(nèi)各試劑組份足夠包裝規(guī)格所標(biāo)示的檢測(cè)次數(shù)。

【儲(chǔ)存條件及有效期】

-20℃±5℃，避光保存、運(yùn)輸、反復(fù)凍融少于 7 次，有效期 9 個(gè)月。

【適用儀器】

ABI 系列 、安捷倫 MX3000P/3005P 、MJ Opticon2 、Eppendorf 2/4 Color Systems、Bio-RadCFX96 等熒光定量 PCR 檢測(cè)儀。

【標(biāo)本采集】

病死或撲殺禽，取喉氣管、腦、胸肌、心肌和肺等組織；待檢活禽，用棉拭子取呼吸道分泌物或排泄物，置于 1mL 50%甘油生理鹽水中。

【保存和運(yùn)輸】

上述標(biāo)本短期內(nèi)可保存于-20℃，長(zhǎng)期保存可置-70℃，但不能超過 6 個(gè)月，標(biāo)本運(yùn)送應(yīng)采用 2~8℃冰袋運(yùn)輸，嚴(yán)禁反復(fù)凍融。

【使用方法】

1.樣品處理（樣本處理區(qū)）

1.1樣本前處理

每份組織分別從 3 個(gè)不同的位置稱取樣品約 1g，手術(shù)剪剪碎混勻后取 0.5g 于研磨器中研磨，加入 1.5mL 生理鹽水后繼續(xù)研磨，待勻漿后轉(zhuǎn)至 1.5mL 滅菌離心管中， 8000rpm 離心 2min，取上清液 100μL 于 1.5mL 滅菌離心管中；棉拭子直接取 100 μL 提取。

1.2RNA 提取

推薦采用上海晅科生物科技有限公司生產(chǎn)的 RNA 提取試劑盒（離心柱提取法），請(qǐng)按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

2.試劑配制（試劑準(zhǔn)備區(qū)）

根據(jù)待檢測(cè)樣本總數(shù)，設(shè)所需要的 PCR 反應(yīng)管管數(shù)為 N(N=樣本數(shù)+1 管陰性對(duì)照+1 管陽(yáng)性對(duì)照；樣品每滿 7 份，多配制 1 份)，每測(cè)試反應(yīng)體系配制如下表：

試劑 AIV-H7N9 反應(yīng)液 酶液

用量 20μL 1μL

將混合好的測(cè)試反應(yīng)液分裝到 PCR 反應(yīng)管中，21uL/管。

3.加樣（樣本處理區(qū)）

將步驟 1 提取的 RNA、陽(yáng)性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品各取 4μL，分別加入相應(yīng)的反應(yīng)管中，蓋好管蓋，混勻，短暫離心。

4.PCR 擴(kuò)增（核酸擴(kuò)增區(qū)）

4.1將待檢測(cè)反應(yīng)管置于熒光定量 PCR 儀反應(yīng)槽內(nèi)；

4.2

設(shè)置好通道、樣品信息，反應(yīng)體系設(shè)置為 25μL；熒光通道選擇： 檢測(cè)通道

（Reporter Dye）FAM、CY5， 淬滅通道（Quencher Dye）選擇 NONE，ABI 系列儀器請(qǐng)勿選擇 ROX 參比熒光，選擇 None 即可。

4.3推薦循環(huán)參數(shù)設(shè)置：

5.結(jié)果分析判定

5.1結(jié)果分析條件設(shè)定

設(shè)置 Baseline 和 Threshold：一般直接按機(jī)器自動(dòng)分析的結(jié)果分析，當(dāng)曲線出現(xiàn)整體傾斜時(shí)，根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié) Baseline 的 start 值(一般可在 3~15 范圍內(nèi)調(diào)節(jié))、stop 值(一般可在 5~20 范圍內(nèi)調(diào)節(jié))，以及 Threshold 的 Value 值(上下拖動(dòng)閾值線至高于陰性對(duì)照)，重新分析結(jié)果。

5.2結(jié)果判斷

FAM 通道為禽流感病毒 H7N9 亞型 H7 基因檢測(cè)結(jié)果，CY5 通道為禽流感病毒H7N9 亞型 N9 基因檢測(cè)結(jié)果

陽(yáng)性：檢測(cè)通道 Ct 值≤35.0，且曲線有明顯的指數(shù)增長(zhǎng)曲線。

可疑：檢測(cè)通道 Ct 值>35.0，且出現(xiàn)明顯擴(kuò)增曲線的樣本建議重復(fù)試驗(yàn)，重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn) Ct 值≤35.0 和明顯擴(kuò)增曲線者為陽(yáng)性，否則為陰性。

陰性：樣本檢測(cè)結(jié)果無 Ct 值且無明顯的擴(kuò)增曲線。

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