激光共聚焦（LSCM）檢測(cè)

一、實(shí)驗(yàn)技術(shù)簡(jiǎn)介

激光掃描共聚焦顯微鏡是采用激光作為光源，在傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡基礎(chǔ)上采用共軛聚焦原理和裝置，并利用計(jì)算機(jī)對(duì)所觀察的對(duì)象進(jìn)行數(shù)字圖象處理的一套觀察、分析和輸出系統(tǒng)。主要系統(tǒng)包括激光光源、自動(dòng)顯微鏡、掃描模塊（包括共聚焦光路通道和針孔、掃描鏡、檢測(cè)器）、數(shù)字信號(hào)處理器、計(jì)算機(jī)以及圖象輸出設(shè)備（顯示器、彩色打印機(jī)）等。通過激光掃描共聚焦顯微鏡，可以對(duì)觀察樣品進(jìn)行斷層掃描和成像。因此，可以無損傷的觀察和分析細(xì)胞的三維空間結(jié)構(gòu)。同時(shí)，通過激光掃描共聚焦顯微鏡也是活細(xì)胞的動(dòng)態(tài)觀察、多重免疫熒光標(biāo)記和離子熒光標(biāo)記觀察的有力工具。
 

二、主要技術(shù)指標(biāo)

1、共聚焦掃描系統(tǒng)

（1）獨(dú)立雙向掃描鏡?？梢栽谡蔑@微鏡和倒置顯微鏡之間迅速互換。儀器permanent不用校正；可調(diào)的計(jì)算機(jī)控制單共焦針孔、孔徑20～600μm

（2）光譜掃描區(qū)400～850nm

（3）單線掃描頻率≥2000線/秒

（4）圖掃描率≥3幅/秒512×512pixels；≥20幅/秒512×32pixels

（5）掃描分辨率4096*4096掃描放大1～32X；多方位序列掃描方式；任意形狀區(qū)域掃描-范圍：≥22mm。

（6）光譜斜陡率  ≤1％

（7）透射光檢測(cè)器用于微分干涉相襯法檢驗(yàn)

（8）低噪音 冷卻型光電倍增管（PNT）控測(cè)器12bi
 

2、激光裝置：具有多通道AOTF（四通道，八譜線），連接四種不同波長的可見光激光可以自動(dòng)選擇激光譜線和功率，具等待功能。光纖耦合連接低能量激光。目前使用五激光，八譜線。Ar激光發(fā)生器 （458nm/5mw，476nm/5mw，488nm/20mw，514nm/20mw）-藍(lán)；He/Ne激光發(fā)生器（543nm/1.2mw）-綠；He/Ne激光發(fā)生器（633nm/10mw，594nm/2mv）-紅，紫外激光發(fā)生器（405nm/25mv）
 

3、顯微鏡：DMIRE2倒置電動(dòng)熒光顯微鏡，擁有10x，20x，40x干鏡以及63x，100x油鏡。配置電動(dòng)編碼物鏡轉(zhuǎn)座，Z軸電動(dòng)驅(qū)動(dòng)和干涉相襯的編碼棱鏡轉(zhuǎn)輪。
 

4、計(jì)算機(jī)工作站：WindowsXP操作系統(tǒng)，8個(gè)同步接收器通道，12bit同步數(shù)字轉(zhuǎn)換，超寬的SCSI電腦介面，高性能的電腦工作站，兩個(gè)監(jiān)視器，計(jì)算機(jī)彩色顯示

5、主要附件和功能：觀察細(xì)胞精細(xì)結(jié)構(gòu)。用于檢測(cè)各種染色，非染色和熒光標(biāo)記的組織和細(xì)胞等，在可見光范圍內(nèi)熒光的定位定量分析，組織光學(xué)切片，基因染色體定位，基因亞細(xì)胞定位，離子通道研究．

三、檢測(cè)的優(yōu)勢(shì)
與傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡相比，主要解決了生物樣品結(jié)構(gòu)相互重疊影響觀察的問題，并可形成清晰的三維圖象。在檢測(cè)方面的主要優(yōu)勢(shì)有：

1、對(duì)活細(xì)胞和組織或細(xì)胞切片進(jìn)行連續(xù)掃描，可獲得精細(xì)的單個(gè)或一群細(xì)胞或者觀察到局部組織的各個(gè)層面結(jié)構(gòu)（包括細(xì)胞特異結(jié)構(gòu)—細(xì)胞骨架、染色體、細(xì)胞器和細(xì)胞膜系統(tǒng)，樣品的深層結(jié)構(gòu)）的三維圖像。

2、細(xì)胞內(nèi)離子熒光標(biāo)記，單標(biāo)記或三奈記，檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)如PH和鈉、鈣、鎂等離子濃度的比率測(cè)定及動(dòng)態(tài)變化。

3、熒光標(biāo)記探頭標(biāo)記的活細(xì)胞或切片標(biāo)本的活細(xì)胞生物物質(zhì)，膜標(biāo)記、免疫物質(zhì)、免疫反應(yīng)、受體或配體，核酸等觀察；可以在同一張樣品上進(jìn)行同時(shí)多重物質(zhì)標(biāo)記，同時(shí)觀察；

4、熒光檢測(cè)快、激發(fā)光強(qiáng)度精確控制、光漂白和熒光淬滅作用??；

5、對(duì)細(xì)胞檢測(cè)無損傷、精確、準(zhǔn)確、可靠和優(yōu)良重復(fù)性；數(shù)據(jù)圖象可及時(shí)輸出或*儲(chǔ)存。

四、樣品要求

樣品制備無特殊要求；各種染色、非染色、熒光標(biāo)記的組織（包括活組織）、培養(yǎng)細(xì)胞、粘附細(xì)胞、細(xì)胞涂片、石蠟切片、冰凍切片。

1、石蠟切片

取材：1、組織離體后需及時(shí)固定；2、組織標(biāo)本不宜過大、過厚。

固定：1、固定液：10%福爾馬林（4%多聚甲醛）或10%中性甲醛；2、用量：一般固定液的量與組織體積比為10:1～20:1；3、固定：適宜的固定時(shí)間，主要根據(jù)材料的大小、松密程度及固定液的穿透速度而定。

保存：切片經(jīng)60℃烤片3-5小時(shí)后，可于常溫或4℃干燥保存。

2、冰凍切片

取材：取材后需立即置于超低溫冰箱或液氮中保存。

固定：樣本冰凍切片后，應(yīng)立即放入甲醇、丙酮、95%酒精、4%多聚甲醛等固定液中固定。

保存：固定好的切片自然風(fēng)干，密封后置于-80℃、-20℃保存，盡快用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

3、細(xì)胞塊石蠟切片

細(xì)胞量較多的樣品，可離心分離所需細(xì)胞，用中性甲醛固定后制作成瓊脂細(xì)胞塊，然后按照制作石蠟切片的操作流程進(jìn)行切片。

4、細(xì)胞爬片

在孔板里做的細(xì)胞爬片，爬片取出后，用PBS洗滌2次（根據(jù)研究目的，PBS洗滌可選擇不做），用4%多聚甲醛4℃固定15分鐘，將表面液體吹干，置于-20℃保存。若在短時(shí)間內(nèi)即開展實(shí)驗(yàn)，可在加固定液后，于4℃冰箱中放置一段時(shí)間。

5、細(xì)胞涂片

細(xì)胞涂片常用的固定液有95%酒精（為常用）、酒精-冰醋酸液、Ethyl ether-酒精液和Carney’s液等。 
 

五、注意事項(xiàng)

1、常用的固定液為中性甲醛和4%多聚甲醛，能使大多數(shù)抗原保存良好，適用于免疫組織化學(xué)。

2、病理實(shí)驗(yàn)切片Best是防脫片，以免實(shí)驗(yàn)過程中出現(xiàn)掉片。若客戶提供切片，應(yīng)告知切片有無防脫處理。

3、骨組織、皮膚組織或脂肪含量較高的樣本，實(shí)驗(yàn)過程中有較高的掉片幾率。

4、客戶可提供組織塊（以10%福爾馬林、4%多聚甲醛或10%中性甲醛固定，如組織塊極小請(qǐng)事先說明）、蠟塊或切片（使用免疫組化切片，以避免實(shí)驗(yàn)過程中掉片）

5、待檢測(cè)蛋白的種屬、實(shí)驗(yàn)分組情況及實(shí)驗(yàn)背景資料、其他具體要求等需事先說明。

6、若客戶提供骨組織或鈣化程度較高的組織進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，需進(jìn)行脫鈣處理。

7、浸泡在固定液中的組織樣本，在運(yùn)輸中容器需密封，防止破碎、滲漏。

六、應(yīng)用領(lǐng)域

1、細(xì)胞生物學(xué)：細(xì)胞結(jié)構(gòu)、細(xì)胞骨架、細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)、流動(dòng)性、受體、細(xì)胞器結(jié)構(gòu)和分布變化、細(xì)胞凋亡； 

2、生物化學(xué)：酶、核酸、FISH（熒光原位雜交）、受體分析

3、藥理學(xué)：藥物對(duì)細(xì)胞的作用及其動(dòng)力學(xué)；

4、生理學(xué)：膜受體、離子通道、細(xì)胞內(nèi)離子含量、分布、動(dòng)態(tài)；

5、遺傳學(xué)和組胚學(xué)：細(xì)胞生長、分化、成熟變化、細(xì)胞的三維結(jié)構(gòu)、染色體分析、基因表達(dá)、基因診斷；

6、神經(jīng)生物學(xué)：神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)、神經(jīng)遞質(zhì)的成分、運(yùn)輸和傳遞、遞質(zhì)受體、離子內(nèi)外流、 神經(jīng)組織（如大腦皮質(zhì)）結(jié)構(gòu)、細(xì)胞分布；

7、微生物學(xué)和寄生蟲學(xué)：細(xì)菌、寄生蟲形態(tài)結(jié)構(gòu)（表面和內(nèi)部結(jié)構(gòu)）；

8、病理學(xué)及病理學(xué)臨床應(yīng)用：活檢標(biāo)本的快速診斷、腫瘤診斷、自身免疫性疾病的診斷，HIV，宮頸上皮細(xì)胞涂片診斷；

9、生物學(xué)、免疫學(xué)、環(huán)境醫(yī)學(xué)和營養(yǎng)學(xué)。