原位雜交（ISH/FISH）實驗

一、實驗技術(shù)簡介
熒光原位雜交（Fluorescence in situ hybridization FISH）是一門新興的分子細胞遺傳學(xué)技術(shù)，是20世紀(jì)80年代末期在原有的放射性原位雜交技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種非放射性原位雜交技術(shù)。目前這項技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于動植物基因組結(jié)構(gòu)研究、染色體精細結(jié)構(gòu)變異分析、病毒感染分析、人類產(chǎn)前診斷、腫瘤遺傳學(xué)和基因組進化研究待許多領(lǐng)域。

二、實驗技術(shù)原理
用已知的標(biāo)記單鏈核酸為探針，按照堿基互補的原則，與待檢材料中未知的單鏈核酸進行異性結(jié)合，形成可被檢測的雜交雙鏈核酸。由于DNA分子在染色體上是沿著染色體縱軸呈線性排列，因而可以探針直接與染色體進行雜交從而將特定的基因在染色體上定位。與傳統(tǒng)的放射性標(biāo)記原位雜交相比，熒光原位雜交具有快速、檢測信號強、雜交特異性高和可以多重染色等特點，因此在分子細胞遺傳學(xué)領(lǐng)域受到普遍關(guān)注。

三、實驗操作流程

1、探針變性：將探針在75℃怛溫水浴中溫育5min，立即置0℃，5～10min，使雙鏈DNA探針變性。
 

2、標(biāo)本變性：

  1）將制備好的染色體玻片標(biāo)本于50℃培養(yǎng)箱中烤片2～3h。（經(jīng)Giemsa染色的標(biāo)本需預(yù)先在固定液中退色后再烤片）。

  2）取出玻片標(biāo)本，將其浸在70～75℃的體積分?jǐn)?shù)70%甲酰胺/2×SSC的變性液中變性2～3min。

  3）立即按順序?qū)?biāo)本經(jīng)體積分?jǐn)?shù)70%、體積分?jǐn)?shù)90%和體積分?jǐn)?shù)*冰乙醇系列脫水，每次5min，然后空氣干燥。
 

3、雜交：將已變性或預(yù)退火的DNA探針10mL滴于已變性并脫水的玻片標(biāo)本上，蓋上18×18蓋玻片，用Parafilm封片，置于源潮濕暗盒中37℃要交過夜（約15～17h）。由于雜交液較少，而且雜交溫度較高，持續(xù)時間又長，因此為了保持標(biāo)本的濕潤狀態(tài)，此過程在濕盒中進行。
 

4、洗脫：此步驟有助于除去非特異性結(jié)合的探針，從而降低本底。

  1）雜交次日，將標(biāo)本從37℃溫箱中取出，用刀片輕輕將蓋玻片揭掉。

  2）將已雜交的玻片標(biāo)本放置于已預(yù)熱42～50℃的體積分?jǐn)?shù)50%甲酰胺/2×SSC中洗滌3次，每次5min。

  3）在已預(yù)熱42～50℃的1×SSC中洗滌3次，每次5min。

  4）在室溫下，將玻片標(biāo)本2×SSC中輕洗一下。
 

5、雜交信號的放大

  1）在玻片的雜交部位加150mL封閉液I，用保鮮膜覆蓋，37℃溫育20min。

  2）去掉保鮮膜，再加150mL avidin-FITC于標(biāo)本上，用保鮮膜覆蓋，37℃繼續(xù)溫育40min。

  3）取出標(biāo)本，將其放入已預(yù)熱42～50℃的洗脫液中洗滌3次，每次5min。

  4）在玻片標(biāo)本的雜交部位加150mL封閉液II，覆蓋保鮮膜，37℃溫育20min。

  5）去掉保鮮膜，加150mL antiavidin于標(biāo)本上，覆蓋新的保鮮膜，37℃溫育40min。

  6）取出標(biāo)本，將其放入已預(yù)熱42～50℃的新洗脫液中，洗滌3次，每次5min。

  7）重復(fù)步驟（1）、（2）、（3），再于2×SSC中室溫清洗一下。

  8）取出玻片，自然干燥。

  9）取200mL PI/antifade染液滴加在玻片標(biāo)本上，蓋上蓋玻片。
 

6、封片：可采用不同類型的封片液。如果封片中不含有Mowiol（可使封片液產(chǎn)生自封閉作用），為防止蓋片與載片之間的溶液揮發(fā)，可使用指甲油將蓋片周圍封閉。封好的玻片標(biāo)本可以在-20～-80℃的冰箱中的暗盒中保持?jǐn)?shù)月之久。
 

7、熒光顯微鏡觀察FISH結(jié)果：先在可見光源下找到具有細胞分裂相的視野，然后打開熒光激發(fā)光源，F(xiàn)ITC的激發(fā)波長為490nm。細胞被PI染成紅色，而經(jīng)FITC標(biāo)記的探針的探針?biāo)谖恢冒l(fā)出綠色熒光。
 

四、樣品要求

樣品制備無特殊要求；各種染色、非染色、熒光標(biāo)記的組織（包括活組織）、培養(yǎng)細胞、粘附細胞、細胞涂片、石蠟切片、冰凍切片。

1、石蠟切片

取材：1、組織離體后需及時固定；2、組織標(biāo)本不宜過大、過厚。

固定：1、固定液：10%福爾馬林（4%多聚甲醛）或10%中性甲醛；2、用量：一般固定液的量與組織體積比為10:1～20:1；3、固定：適宜的固定時間，主要根據(jù)材料的大小、松密程度及固定液的穿透速度而定。

保存：切片經(jīng)60℃烤片3-5小時后，可于常溫或4℃干燥保存。

2、冰凍切片

取材：取材后需立即置于超低溫冰箱或液氮中保存。

固定：樣本冰凍切片后，應(yīng)立即放入甲醇、丙酮、95%酒精、4%多聚甲醛等固定液中固定。

保存：固定好的切片自然風(fēng)干，密封后置于-80℃、-20℃保存，盡快用于后續(xù)實驗。

3、細胞塊石蠟切片

細胞量較多的樣品，可離心分離所需細胞，用中性甲醛固定后制作成瓊脂細胞塊，然后按照制作石蠟切片的操作流程進行切片。

4、細胞爬片

在孔板里做的細胞爬片，爬片取出后，用PBS洗滌2次（根據(jù)研究目的，PBS洗滌可選擇不做），用4%多聚甲醛4℃固定15分鐘，將表面液體吹干，置于-20℃保存。若在短時間內(nèi)即開展實驗，可在加固定液后，于4℃冰箱中放置一段時間。

5、細胞涂片

細胞涂片常用的固定液有95%酒精（為常用）、酒精-冰醋酸液、Ethyl ether-酒精液和Carney’s液等。 
 

五、其他及注意事項

1、配制時應(yīng)在通風(fēng)條件下操作，并避免接觸皮膚和吸入（戴手套及口罩），因PFA有較強的固定作用及毒性，對粘膜及皮膚有固定及毒性，刺激作用；

2、加熱時，溫度不宜過高，常為60~65℃，否則，PFA降解失效；

3、配制好的PFA雖可存放一定時間，但過久的液體，固定效果下降，應(yīng)盡早使用。

4、4% PFA是目前原位雜交組織化學(xué)技術(shù)中常用的固定液，它能較好地保持組織及細胞內(nèi)的RNA，同時對形態(tài)保持也較好。樣品固定時間在2～3小時，RNA含量較為恒定。過度延長固定時間會引起細胞內(nèi)生物大分子的過度交聯(lián)，影響探針的穿透力，降低雜交效率。