分子機制的研究

1、提供各種分子機制整體實驗方案：客戶根據(jù)課題標書及需做實驗的主體內(nèi)容，擬定并提供初步的項目方案，含課題申請書，實驗方案，實驗設計，實驗思路，實驗文獻等與實驗相關等內(nèi)容和資料?；蛘哂杉蚊缹嶒瀰f(xié)助實驗委托者完成各種分子機制整體實驗方案的設計。

2、項目評估報價：公司技術團隊根據(jù)客戶提供的相關資料，綜合評估項目可行性，與客戶共同確定準確的實驗項目執(zhí)行方案，給出準確的實驗價格。嘉美實驗協(xié)助設計的課題直接給出準確的報價。

3、簽訂服務協(xié)議：簽署服務協(xié)議并預付部分費用，做好實驗初步準備及項目預安排。

4、執(zhí)行服務項目：正式啟動實驗進程，全面展開實驗，確保項目有效執(zhí)行。

5、溝通項目進展：及時溝通反饋實驗的Newest進展，隨時了解掌控實驗的Newest動態(tài)。

6、完成項目交付：支付剩余尾款，交付實驗結果，正確應用實驗結果，提供售后服務。  

一、分子機制研究介紹
1、分子機制研究概述
分子機制是指生物機體結構組成部分的相互關系，以及其間發(fā)生的各種變化過程的物理、化學性質(zhì)和相互關系。現(xiàn)代分子醫(yī)學的目的，就是從分子機制的角度解釋疾病發(fā)生、發(fā)展等過程，并從中發(fā)展出相關的疾病風險預測、預防、診斷和治療技術。通過分子醫(yī)學實驗室研究，可利用分子、細胞生物學等研究手段闡明疾病發(fā)生發(fā)展的分子機制，篩選疾病診斷的生物標志物，確定疾病治療/干預的靶點，從而實現(xiàn)藥物的創(chuàng)制。在臨床上，醫(yī)生可基于分子醫(yī)學的臨床決策，通過基因組醫(yī)學實現(xiàn)風險預測，通過生物標志物實現(xiàn)疾病診斷，通過個體化醫(yī)療實現(xiàn)疾病治療。

2、分子醫(yī)學重點研究領域
  1）疾病發(fā)生、發(fā)展的分子機制
  2）基因、遺傳與疾病的關系
  3）個體化治療的分子基礎
  4）治療有效性判斷的分子基礎

3、分子醫(yī)學發(fā)展方向：
1）從機理發(fā)現(xiàn)向醫(yī)學應用的轉(zhuǎn)化
 2）新的細胞信號轉(zhuǎn)導途徑

二、嘉美實驗分子機制研究的五個經(jīng)驗
五個經(jīng)驗分別為：信號通路; 明星分子; 中心法則; 工具分子; 具體位點;
1、信號通路
信號通路非常多，找到一條是關鍵，通路關系太復雜，講不清楚影響這個實驗設計。確定信號通路的方法有很多，特別是當我們已經(jīng)把一個基因的細胞和動物功能闡述清楚后：
  1）通過文獻報道或者已知經(jīng)驗，比如分子A的功能是影響細胞自噬，那么像PI3K-Akt-mTOR通路等就是我們可以直接通過閱讀綜述獲取的；
  2）通過RNA-seq或者芯片或者其它組學手段，篩選差異基因并對差異基因進行pathway或者GSEA富集分析，從而找到可能被基因A調(diào)控的信號通路；
  3）通過數(shù)據(jù)庫預測，比如基于與基因A存在共表達關系來分析周圍基因所參與的通路，從而得到A可能參與的通路，我們可以通過cbioportal/GEPIA對TCGA收錄腫瘤中的信息進行分析，也可以分析GEO等非腫瘤的共表達結果，甚至有一些網(wǎng)站直接收錄了這種共表達關系。

2、明星分子
明星分子選得好，文章分數(shù)才能高，中游節(jié)點較常選，上下連接左右逢源。明星分子的概念大而且含糊，盡管通路是一個大的網(wǎng)絡，但是總體上上下游關系還是存在的，如果簡單來劃分可以分為上游，中游和下游三段，三者之間沒有嚴格的界限，一般的通路常常出現(xiàn)分子類型有：配體與受體，激酶/磷酸酶（去/泛素化酶）與底物，轉(zhuǎn)錄因子和靶基因等，以TGFβ-Smad通路為例，如果把細胞膜和核膜作為上中下分類的區(qū)分點，可以粗略的這么劃分和標注：

那么在這個通路里面什么分子是明星分子呢？一般來說，大家選的重點集中在中游這個范圍內(nèi)，下游的分子（比如圖中的p15）一般用來作為細胞表型（細胞周期）的證據(jù)，可能考慮到膜蛋白研究的復雜和困難性，大家也很少選擇上游的分子，所以中游的分子就成了明星分子選擇的重點了，特別是通路的名字叫做TGFβ-Smad，所以很多研究就是圍繞Smad這個蛋白展開，比如Smad這個家族的蛋白即是轉(zhuǎn)錄因子，可以通過結合靶基因的DNA調(diào)控分子表達，其本身又可以被磷酸化發(fā)揮功能，所以又是激酶-底物這一關系中的底物這一角色，因此激酶-Smad-磷酸化的Smad（轉(zhuǎn)錄因子）-靶基因就成了一個信號軸。

  3、中心法則
中心法則像樓梯，三個水平無數(shù)級，從大到小逐層找，推理驗證需要多方面進行。

當我們選好明星分子以后，調(diào)控層次就是要考慮的問題了，這里說的調(diào)控層次就是圍繞中心法則展開對明星分子本身的探索，我們知道中心法則涉及到DNA-RNA-蛋白三個層面，根據(jù)調(diào)控的層次一般我們又分為轉(zhuǎn)錄水平和轉(zhuǎn)錄后水平，轉(zhuǎn)錄我們知道是發(fā)生在細胞核里面的。所以我們看到某個分子定位在細胞核時我們一般就從轉(zhuǎn)錄水平進行考慮，比如轉(zhuǎn)錄因子對DNA序列的結合，DNA甲基化、組蛋白修飾等等，而當RNA被轉(zhuǎn)錄出來后要經(jīng)過加工過程，比如可變剪接，miRNA介導的降解，mRNA翻譯成蛋白，蛋白合成后會被磷酸化修飾或者泛素化修飾從而激活或者降解等等，這些是轉(zhuǎn)錄后的水平。那么我們在確定明星分子后，一般來說需要首先確定的是變化發(fā)生在哪個層面，是RNA還是蛋白，是蛋白的產(chǎn)生（翻譯）、降解（比如泛素化）還是活化（比如磷酸化），從而把研究的焦點集中到明星分子的某個過程，這個層面是圍繞一個明星分子的前世今生來展開的。

4、工具分子
一個結果多個因素，工具分子一大群，具體哪個有作用，一般情況用免疫沉淀IP來驗證準確性。

確定了明星分子在哪個層面被調(diào)控后，就要找相應的工具分子了，工具分子是指像酶（比如激酶、泛素酶、甲基化酶）、轉(zhuǎn)錄因子、翻譯因子、剪接因子等為主的一系列蛋白，每個系列的工具分子一般都有很多，比如泛素酶就有成百上千個，那具體是哪一個導致明星分子被泛素化呢？以免疫沉淀（IP）技術為基礎延伸出來的各種分子就是用來找這類工具分子的較常用策略，比如通過IP加質(zhì)譜鑒定與明星分子作用的泛素化酶，通過RNA pulldown加質(zhì)譜鑒定與RNA結合的工具蛋白（如翻譯因子和剪接因子），通過RIP-seq來尋找與蛋白結合的RNA，通過ChIP-Seq來尋找與蛋白結合的DNA序列（如靶基因）等等。找到工具分子后，作用的信號軸就有了：某基因（因素）通過（4）工具分子從（2）明星分子（3）某個層面調(diào)控（1）某條信號通路。

5、 具體位點
分子整體有作用，具體位點講不清，可以拆開組合來驗證。

這一步就是要進一步把明星分子和工具分子進行拆解，工具分子揍了明星分子一頓，具體是揍了一拳還是踢了一腳，工具分子的一拳打在了明星分子的臉上還是肚子上，這個是兩個要交代清楚的問題，所以就要把工具分子和明星分子中發(fā)揮功能的位點、序列或者結構域找到，找到后就可以更加清楚的描述了：工具分子左拳打在了明星分子頭上，具體位置是打在了太陽穴上，把明星分子打死了，這樣導致一個以明星分子為中心的網(wǎng)絡（信號通路）出現(xiàn)崩潰或者癱瘓，異常（疾?。┚统霈F(xiàn)了。所以我們在文章中常?？吹揭训鞍赘鶕?jù)結構域進行分段，把RNA根據(jù)序列長度進行分段，然后再看他倆之間還有沒有作用。

三、分子機制研究的五個層次
層次一：相關性；一般對應的文章分數(shù)在1-3分左右；
層次二：因果關系；一般對應的文章分數(shù)在3-5分左右；
層次三：直接作用；一般對應的文章分數(shù)在5-10分左右；
層次四：嵌套組合；一般對應的文章分數(shù)在10-20分左右；
層次五：觀念創(chuàng)新；文章的層次是CNS級別。
 

1、層次一：相關性
兩個因素的相關性是做機制研究的*層關系，也是弱的關系。這里的因素可以是藥物、基因、現(xiàn)象等等，比如基因A的表達水平與肝癌腫瘤病人的預后、藥物的濃度與細胞凋亡的比率等等。對于疾病的研究來說，如果某因素與疾病進展或者預后有強相關性，就可能把該因素作為疾病進展或者預后的marker，比如甲胎蛋白AFP之于肝癌，所以有一類研究稱之為偽基礎研究，研究的名字比如：Prognostic Significance of gene A expression in B disease. 或者Association between gene A and B disease.

相關性是弱的邏輯聯(lián)系，因為兩個因素之間存在相關性有可能是*沒有邏輯的，比如北京的房價與肺癌的發(fā)病率之間的相關性。

2、層次二：因果關系
在相關性的基礎上深入的一層關系是因果關系，即因果關系是相關性的子集。如果A基因表達或者突變與B疾病之間存在相關性，那么有可能把A因素作為B疾病的biomarker；如果A基因是B疾病的原因，那么可以通過干預A基因影響B(tài)疾病進展。
  1）在分子機制研究中，因果關系的存在是要證明的*步，比如在進行某中藥通過AMPK信號通路抑制細胞增殖的研究中，為了說明某中藥調(diào)控AMPK信號通路，我們較常規(guī)的手段就是通過WB檢測AMPK信號通路以及下游分子的表達或者活化狀態(tài)，就是證明中藥Z劑量與AMPK通路分子表達的因果關系。
  2）為了證明因果關系的第二個部分就是挽救實驗，即如果上調(diào)A因素導致了B結果的出現(xiàn)，對A因素的下調(diào)是否可以逆轉(zhuǎn)B結果的出現(xiàn)。

3、層次三：直接作用
承接第二個層次，如果A因素是導致B結果出現(xiàn)的原因，那么A因素是直接原因呢還是間接原因？對應到分子機制研究中就是這樣：A基因的上調(diào)導致了B蛋白的磷酸化，那么A基因直接與B相互作用介導的（直接作用）還是通過C介導的呢？
  1）為了證明這一點，通常用分子間的直接作用來驗證，比如蛋白與蛋白作用的co-IP，GSTPulldown，蛋白與RNA作用的RIP、RNApulldown，蛋白與DNA作用的CHIP、EMSA等等，就是為了判斷兩者之間的直接還是間接作用。
  2）在以分子為單位的研究中，第二部分就是“分子局部”研究，比如已經(jīng)證明了蛋白A與RNA B是直接結合的，“分子局部”研究就是確定蛋白A的什么局部（哪些氨基酸形成的結構域）與RNA B的哪段序列直接結合。
做到這一步，絕大多數(shù)分子研究的深度就夠了，即使是top-levelCNS級別的文章要求也不過如此。

4、層次四：嵌套組合
既然第三層次分子機制的研究深度已經(jīng)夠CNS級別的文章了，第四層次就不僅僅是研究深度的問題了，而是故事的豐富度，有一個觀點就是從第三層次到第四層次的升級：單線到多線的過渡，即把幾個第三層次的單線研究嵌套組合為一個故事，第三層次要求把一個故事的一條線講清楚，第四層次要求把一個故事的多條線講清楚，而多條故事線的匯總形式有很多：比如雙頭蛇模式、反饋回路模式等等。

比如在第三層次的研究中，已經(jīng)通過各種實驗證明了lncRNAA通過抑制蛋白B的降解上調(diào)B的表達，在第四層次中雙頭蛇模式是：lncRNAA 除了通過抑制蛋白B的降解上調(diào)B的表達（層次三），還可以通過ceRNA的方式下調(diào)microRNAC表達從而促進B的表達；反饋回路模式則是：lncRNAA除了通過抑制蛋白B的降解上調(diào)B的表達（層次三），而上調(diào)表達的蛋白B促進了lncRNAXXX的轉(zhuǎn)錄，從而形成正反饋回路。

5、層次五：觀念創(chuàng)新
層次五就是高層次，即觀念層面的創(chuàng)新，一般到這個層次就是CNS級別了，比如新現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)、兩個貌似沒有關系的現(xiàn)象之間聯(lián)系的揭示等，這點大家看CNS的文章應該有感觸，舉個例子：外泌體的形成與細胞自噬之間有沒有關系呢？