信號通路整體實驗

1、提供各類信號通路整體實驗方案：客戶根據(jù)課題標(biāo)書及需做實驗的主體內(nèi)容，擬定并提供初步的項目方案，含課題申請書，實驗方案，實驗設(shè)計，實驗思路，實驗文獻等與實驗相關(guān)等內(nèi)容和資料?；蛘哂杉蚊缹嶒瀰f(xié)助實驗委托者完成各類信號通路整體實驗方案的設(shè)計。

2、項目評估報價：公司技術(shù)團隊根據(jù)客戶提供的相關(guān)資料，綜合評估項目可行性，與客戶共同確定準(zhǔn)確的實驗項目執(zhí)行方案，給出準(zhǔn)確的實驗價格。嘉美實驗協(xié)助設(shè)計的課題直接給出準(zhǔn)確的報價。

3、簽訂服務(wù)協(xié)議：簽署服務(wù)協(xié)議并預(yù)付部分費用，做好實驗初步準(zhǔn)備及項目預(yù)安排。

4、執(zhí)行服務(wù)項目：正式啟動實驗進程，全面展開實驗，確保項目有效執(zhí)行。

5、溝通項目進展：及時溝通反饋實驗的Newest進展，隨時了解掌控實驗的Newest動態(tài)。

6、完成項目交付：支付剩余尾款，交付實驗結(jié)果，正確應(yīng)用實驗結(jié)果，提供售后服務(wù)。

一、信號通路整體實驗介紹
1、信號通路簡單介紹：是指能將細胞外的分子信號經(jīng)細胞膜傳入細胞內(nèi)發(fā)揮效應(yīng)的一系列酶促反應(yīng)通路。這些細胞外的分子信號（稱為配體，ligand）包括激素、生長因子、細胞因子、神經(jīng)遞質(zhì)以及其它小分子化合物等。細胞內(nèi)各種不同的生化反應(yīng)途徑都是由一系列不同的蛋白組成的，執(zhí)行著不同的生理生化功能。各個信號通路中上游蛋白對下游蛋白活性的調(diào)節(jié)（包括激活或抑制作用）主要是通過添加或去除磷酸基團，從而改變下游蛋白的立體構(gòu)象完成的。所以，構(gòu)成信號通路的主要成員是蛋白激酶和磷酸酶，它們能夠快速改變和恢復(fù)下游蛋白的構(gòu)象。從細胞受體接收外界信號到后做出綜合性應(yīng)答，不僅是一個信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，更重要的是將外界信號進行逐步放大的過程。受體蛋白將細胞外信號轉(zhuǎn)變?yōu)榧毎麅?nèi)信號，經(jīng)信號級聯(lián)放大、分散和調(diào)節(jié)，終產(chǎn)生一系列綜合性的細胞應(yīng)答，包括下游基因表達的調(diào)節(jié)、細胞內(nèi)酶活性的變化、細胞骨架構(gòu)型和DNA合成的改變等。這些變化并非都是由一種信號引起的，也可以通過幾種信號的不同組合產(chǎn)生不同的反應(yīng)。

2、常見的信號通路：
  1）JAK-STAT信號通路
JAK-STAT信號通路是近年來發(fā)現(xiàn)的一條由細胞因子刺激的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，參與細胞的增殖、分化、凋亡以及免疫調(diào)節(jié)等許多重要的生物學(xué)過程。與其它信號通路相比，這條信號通路的傳遞過程相對簡單，它主要由三個成分組成，即酪氨酸激酶相關(guān)受體、酪氨酸激酶JAK和轉(zhuǎn)錄因子STAT。許多細胞因子和生長因子通過JAK-STAT信號通路來傳導(dǎo)信號，這包括白介素27（IL-27）、GM-CSF（粒細胞/巨噬細胞集落刺激因子）、GH（生長激素）、EGF（表皮生長因子）、PDGF （血小板衍生因子）以及IFN（干擾素）等等。
  2）p53信號通路
p53基因是迄今發(fā)現(xiàn)與腫瘤相關(guān)性高的基因。1979年，Lane和Crawford在感染了SV40的小鼠細胞內(nèi)分離獲得一個與SV40大T抗原相互作用的蛋白，因其分子量為53 kDa，故而取名為p53（人的基因稱為TP53）。之后，在基因同源性的基礎(chǔ)上又陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了p73和p63，它們也因各自的分子量而得名，具有和p53相似的結(jié)構(gòu)和功能。p53基因受多種信號因子的調(diào)控。雖然正常狀態(tài)下p53的mRNA水平很高，而且有大量蛋白質(zhì)合成，但p53蛋白容易降解，所以正常細胞內(nèi)p53蛋白水平很低。p53基因敲除小鼠雖然可以產(chǎn)生后代，但其生長發(fā)育過程中會出現(xiàn)高頻率的自發(fā)性腫瘤，這提示p53蛋白與腫瘤之間存在密切的關(guān)系。
  3）NF-kB信號通路
NF-κB是屬于Rel家族的轉(zhuǎn)錄因子，參與調(diào)節(jié)與機體免疫、炎癥反應(yīng)、細胞分化有關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄。哺乳動物細胞中有五種NF-κB/Rel都具有Rel同源區(qū)，能形成同或異二聚體，啟動不同的基因轉(zhuǎn)錄。靜息狀態(tài)下，NF-κB二聚體與抑制蛋白IκB結(jié)合成三聚體而被隱蔽于細胞質(zhì)，胞外刺激可激活I(lǐng)κB的泛素化降解途徑，而使NF–κB二聚體進入胞核，調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄。
  4）Wnt信號通路
Wnt是一類分泌型糖蛋白，廣泛存在于無脊椎動物和脊椎動物中，是一類在物種進化過程中高度保守的信號通路，通過自分泌或旁分泌發(fā)揮作用。Wnt信號在動物胚胎的早期發(fā)育、器官形成、組織再生和其它生理過程中，具有至關(guān)重要的作用。在小鼠中，腫瘤病毒整合在Wnt之后而導(dǎo)致乳腺癌。卷曲蛋白（Frz）作為Wnt受體，其胞外N端具有富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域， Frz作用于胞質(zhì)內(nèi)的蓬亂蛋白（Dsh），Dsh能切斷β-catenin的降解途徑，從而使β-catenin在細胞質(zhì)中積累，并進入細胞核，與T細胞因子（TCF/LEF）相互作用，調(diào)節(jié)靶基因的表達。
  5）BMP信號通路
BMP（骨形態(tài)發(fā)生蛋白，bone morphogenetic protein）是TGF-β（轉(zhuǎn)化生長因子，transforming growth factor-β）超家族中的重要成員。它通過調(diào)節(jié)一系列下游基因的活性，控制著諸如中胚層形成、神經(jīng)系統(tǒng)分化、牙齒和骨骼發(fā)育以及癌癥發(fā)生等許多重要的生物學(xué)過程。
  6）Notch信號通路
Notch基因早發(fā)現(xiàn)于果蠅，部分功能缺失導(dǎo)致翅緣缺刻。在胚胎發(fā)育中，當(dāng)上皮組織的前體細胞中分化出神經(jīng)元細胞后，其細胞表面Notch配體Delta與相鄰細胞膜上的Notch結(jié)合，啟動信號通路，防止其它細胞發(fā)生同樣的分化。當(dāng)配體和相鄰細胞的Notch結(jié)合后，Notch被蛋白酶體切割，釋放出具有核定位信號的胞質(zhì)區(qū)ICN，進入細胞核與CLS結(jié)合，調(diào)節(jié)基因表達。

二、信號通路研究三部曲
1、信號通路家族龐大，種類繁多，成員更是多不勝數(shù)，它們彼此之間的關(guān)系錯綜復(fù)雜，*無跡可尋。有時同一個通路中既有想要研究的，又有不需要研究的，比如P53通路不僅在細胞周期中展露，還總是在細胞周期、凋亡、DNA修復(fù)等過程中橫插一腳。有時某個信號通路的家族圖譜一眼望去密密麻麻（如下圖），看的人暈暈乎乎，一臉懵逼，除了感嘆“貴圈真亂”，簡直不知道如何揭示該家族隱藏的“奧秘”。
 

2、盡管信號通路中成員眾多，但是大多數(shù)都是跑龍?zhí)?，而只有位于信號中心的核心分子才算得上是真正紅的發(fā)紫的“大腕”。由于它們的一舉一動都牽扯整個家族的命運，信號通路常常會以它們的名稱命名，比如TGF-β/Smad、Jak/Stat、MAPK/ERK等。此時，科研者們大可盯緊這些大腕，地毯式調(diào)查其上下游的其他分子，如果能有幸碰到其他“明星分子”，如PTEN、KRAS、FOXO1等，也許你就會對大腕與明星分子之間的“愛恨糾葛”有了深入的了解。

3、正所謂人紅粉絲多，有的明星通路追捧者甚多，其間種種八卦早已見于報端，那么再想對其進入深入挖掘看起來似乎是一件耗費精力且不討好的事情。可是，有的小伙伴就是不死心，就是想以此明星通路博得心儀雜志的青睞，此時倒是可以另辟蹊徑：去研究某種特定細胞（細胞X）類型中的一個熱點信號通路的作用。

4、以信號通路A-B-C為例，研究者在選擇特定細胞時，要先了解該細胞的生理功能及其在某種疾病中所發(fā)揮的重要性；并確定該通路A-B-C在細胞X中的功能研究仍處于空白狀態(tài)，有一定的研究意義。而后便可按以下研究思路進行研究。
   
1）某信號通路與細胞X的相關(guān)性。證明通路A-B-C與細胞X的病理狀態(tài)之間存在相關(guān)性?？赏ㄟ^涵蓋多種通路的手段進行中等通量的篩選（如蛋白芯片或PCR芯片），來確保信號通路A-B-C參與細胞X病變的生理過程；以及通過WB、qPCR等實驗確定該通路A-B-C中關(guān)鍵分子的變化，如表達差異，定位異常、活性變化等。
2）通路中A分子與細胞X病變間的因果關(guān)系。
以分子A為例，構(gòu)建A在X細胞中特定敲除的小鼠模型，并檢測出相應(yīng)的表型，可確定A分子的變化與細胞X病變之間存在一定的因果關(guān)系；并用挽救實驗（rescue experiment）進行驗證，即上調(diào)A分子表達檢測細胞X的相應(yīng)表型能否得以恢復(fù)。
3）檢測通路關(guān)鍵分子間的相互作用方式。以該分子為基礎(chǔ)，通過分子互作實驗技術(shù)（如IP、GST-Pull down等）、分子定位、活性、構(gòu)象等檢測手段，來明確分子間作用的方式（分子A與分子C之間是直接作用，還是通過分子B進行間接作用），以及分子A的結(jié)合序列、結(jié)構(gòu)域等。