CRISPR/Cas9整體實(shí)驗(yàn)服務(wù)

1、提供項(xiàng)目CRISPR/Cas9整體實(shí)驗(yàn)方案：客戶根據(jù)課題標(biāo)書及需做實(shí)驗(yàn)的主體內(nèi)容，擬定并提供初步的項(xiàng)目方案，含課題申請(qǐng)書，實(shí)驗(yàn)方案，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，實(shí)驗(yàn)思路，實(shí)驗(yàn)文獻(xiàn)等與實(shí)驗(yàn)相關(guān)等內(nèi)容和資料。或者由嘉美實(shí)驗(yàn)協(xié)助實(shí)驗(yàn)委托者完成CRISPR/Cas9整體實(shí)驗(yàn)方案的設(shè)計(jì)。
2、項(xiàng)目評(píng)估報(bào)價(jià)：公司技術(shù)團(tuán)隊(duì)根據(jù)客戶提供的相關(guān)資料，綜合評(píng)估項(xiàng)目可行性，與客戶共同確定準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目執(zhí)行方案，給出準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)價(jià)格。嘉美實(shí)驗(yàn)協(xié)助設(shè)計(jì)的課題直接給出準(zhǔn)確的報(bào)價(jià)。
3、簽訂服務(wù)協(xié)議：簽署服務(wù)協(xié)議并預(yù)付部分費(fèi)用，做好實(shí)驗(yàn)初步準(zhǔn)備及項(xiàng)目預(yù)安排。
4、執(zhí)行服務(wù)項(xiàng)目：正式啟動(dòng)實(shí)驗(yàn)進(jìn)程，全面展開實(shí)驗(yàn)，確保項(xiàng)目有效執(zhí)行。
5、溝通項(xiàng)目進(jìn)展：及時(shí)溝通反饋實(shí)驗(yàn)的Newest進(jìn)展，隨時(shí)了解掌控實(shí)驗(yàn)的Newest動(dòng)態(tài)。
6、完成項(xiàng)目交付：支付剩余尾款，交付實(shí)驗(yàn)結(jié)果，正確應(yīng)用實(shí)驗(yàn)結(jié)果，提供售后服務(wù)。

一、嘉美實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的CRISPR/Cas9 基因編輯穩(wěn)定細(xì)胞株案例的實(shí)驗(yàn)步驟
 

嘉美實(shí)驗(yàn)擁有完善的 CRISPR/Cas9 載體系統(tǒng)，包括單敲除，雙敲除，缺口酶、慢病毒敲除載體和敲除載體庫等體系。并且每一個(gè)載體系統(tǒng)都有不同的標(biāo)簽（EGFP/RFP/Puro/Neo）可供選擇。同時(shí)，擁有 100 余種基因敲除的項(xiàng)目經(jīng)驗(yàn)，可以快速、準(zhǔn)確、高效的完成任何一個(gè)基因敲除的項(xiàng)目。

1、設(shè)計(jì)針對(duì) Atg10基因的 gRNA并克隆到嘉美實(shí)驗(yàn)的 pGK1.1敲除載體中；
2、電轉(zhuǎn) pGK1.1（Atg10）載體至 K562細(xì)胞中；

3、Cruiser™酶切計(jì)算突變率（圖1）；

4、單克隆篩選用 Cruiser™酶切驗(yàn)證獲得潛在陽性克?。▓D2）；

5、對(duì)潛在的陽性克隆進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，獲得純合子；

圖1. Cruiser™酶切細(xì)胞池，計(jì)算突變率。

圖3. 潛在陽性克隆測(cè)序比對(duì)結(jié)果
根據(jù)潛在陽性克隆單克隆測(cè)序驗(yàn)證結(jié)果，判斷該株疑似陽性克隆的兩個(gè)親本都缺失11bp堿基，該株陽性克隆為純合子敲除細(xì)胞株。

 

二、CRISPR-Cas系統(tǒng)介紹

CRISPR-Cas系統(tǒng) The clustered, regularly interspaced, short palindromic repeats-associated protein systems）是一個(gè)細(xì)菌及古細(xì)菌進(jìn)化出來用以抵御病毒和質(zhì)粒入侵的適應(yīng)性機(jī)制。CRISPR-Cas系統(tǒng)的高效基因組編輯功能已被應(yīng)用于多種生物，包括斑馬魚、小鼠、大鼠、秀麗隱桿線蟲、植物及細(xì)菌。多個(gè)科研小組的研究都顯示，與鋅指核酸酶（ZFNs）和轉(zhuǎn)錄激活樣效應(yīng)核酸酶（Transcription activator-like effector nucleases, TALEN）相比較，CRISPR-Cas系統(tǒng)介導(dǎo)的基因組靶向?qū)嶒?yàn)在細(xì)胞或斑馬魚中具有相似甚至更高的效率。
 

在 II型CRISPR系統(tǒng) 中，CRISPR RNA（crRNA）與轉(zhuǎn)錄激活crRNA（Trans-activating crRNA, tracrRNA）退火形成的復(fù)合物能特異識(shí)別基因組序列，引導(dǎo)Cas9核酸內(nèi)切酶在目的片段生成DNA雙鏈斷裂（double-strand breaks, DSBs）。 這個(gè)識(shí)別復(fù)合體可以通過融合crRNA與tracrRNA序列形成sgRNA（single-guided RNA）進(jìn)行簡(jiǎn)化。基因組的靶序列中有長(zhǎng)約20bp的片段與crRNA或sgRNA互補(bǔ)配對(duì)；靶序列末端的三核苷酸區(qū)域PAM（5’-NGG-3’）為Cas9識(shí)別位點(diǎn)，是實(shí)現(xiàn)剪切功能的關(guān)鍵。

CRISPR-Cas9體系 的RNA-DNA識(shí)別機(jī)制為基因 組工程研究提供了一項(xiàng)簡(jiǎn)便而強(qiáng)大的工具。該體系其中一個(gè)重要的優(yōu)勢(shì)是Cas9蛋白可在多個(gè)不同的gRNA的引導(dǎo)下同時(shí)靶向多個(gè)基因組位點(diǎn)

圖 1. CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因組編輯原理圖
 

圖2. CRISPR-Cas9介導(dǎo)的基因編輯。
（左）：sgRNA引導(dǎo)Cas9核酸酶作用于基因組，形成的DSBs被非同源末端連接（NHEJ）機(jī)制修復(fù)；
（右）：sgRNA引導(dǎo)Cas9核酸酶作用于基因組，形成DSBs，同源重組（HR）作用下，供體質(zhì)粒上的目標(biāo)基因及篩選標(biāo)記（或其他遺傳元件）在斷裂處被整合進(jìn)基因組。
 

圖3: 切口酶在結(jié)合鏈生產(chǎn)單鏈切口的原理圖