適用于中國區(qū)域CDV,CPV,CCV病毒診斷的配對(duì)單抗全新上市

                       武玉香

一，研究背景

犬瘟熱是一種急性、傳染性*的病毒病,在幼犬中本病的死亡率較任何其他傳染病為高。犬瘟熱也是水貂的一種傳染病,又稱貂瘟,死亡率很高,引起嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。

犬瘟熱病毒(Canine distemper virus)粒子呈現(xiàn)多形性,多數(shù)為球形,病毒粒子的直徑為110~550nm,大多數(shù)在150~330nm之間,亦有畸形和長絲狀的病毒粒子,病毒的基因組為不分節(jié)、非重疊的負(fù)鏈RNA,由15616個(gè)核苷酸組成,從它的3端到5'端依次為3’端前導(dǎo)序列、核衣殼基因、磷蛋白基因、基質(zhì)膜蛋白基因、融合蛋白基因、附著或血凝蛋白基因和5端引導(dǎo)序列。病毒粒子中的主要蛋白質(zhì)有核衣殼蛋白(nucleocapsid protein,N)、磷蛋白(phosphoprotein,P)、融合蛋白白(fusion protein,F)、附著或血凝蛋白(attachment protein or hemagglutinin protein,H)。負(fù)鏈RNA被一個(gè)螺旋狀衣殼包裹,主要由N組成,P和L也是核衣殼的成分。核衣殼呈螺旋狀,總長度為1000nm,螺旋直徑15~19nm,螺旋中心有5nm的孔,螺距5~6nm,核衣殼由囊膜包裹,其內(nèi)部為M,厚約5nm,表面為H和F兩個(gè)糖蛋白組成的纖突,纖突的長度為9nm。    本病毒在-10度可生存幾個(gè)月,在-70℃或凍干條件下可長期存活;在0℃以上感染力迅速喪失。干燥的病毒在室溫中尚穩(wěn)定。病毒在pH3.0時(shí)不穩(wěn)定,在pH4.5以上時(shí)尚穩(wěn)定,pH7.0有利于病毒的保存。可見光容易將病毒滅活。對(duì)**敏感。0.1%甲醛或1%煤酚皂溶液在幾小時(shí)內(nèi)滅活病毒,病毒經(jīng)甲醛滅活后仍能保留其抗原性。
     犬細(xì)小病毒( Canine parvovirus,CPV)于 1978 年同時(shí)從澳大利亞(Kely)、

加拿大( Thomson 等)患腸炎的病犬中分離獲得,是繼 1967 年 Binn 等從犬分離的第二種細(xì)小病毒,是繼1967年Binn等從犬分離的第二種細(xì)小病毒,它與Binn早期從健康犬分離的犬極小病毒( Minute virus of canine,MVC)在致病性上顯著不同,抗原性上也有明顯差異。CPV可引起犬出血性腹瀉和心肌炎,并使白細(xì)胞大量減少,在幼犬中的發(fā)病率和死亡率都很高,癥狀與貓泛白細(xì)胞減少癥相似。而MVC的致病性迄今尚未明確,雖然某些犬群的抗體陽性率很高(達(dá)70%)。

本病雖發(fā)現(xiàn)時(shí)間不長,但在歐、美等一些商業(yè)性飼犬場,相繼有流行和造成幼犬群損失的報(bào)道。除上述早報(bào)道的兩個(gè)國家外,已相繼在美國、英國、德國和法國發(fā)現(xiàn),當(dāng)前已成為犬的一種重要傳染病,我國亦有本病的暴發(fā)流行,并已分離獲得多株病毒,研究報(bào)道日趨增多,并發(fā)現(xiàn)它在抗原性上與貓泛白細(xì)胞減少癥病毒有密切關(guān)系。

犬冠狀病毒( Canine coronavirus,CCV)引起犬的胃腸炎,1971年*在美國發(fā)生腹瀉軍犬的糞便中電鏡檢出該病毒。犬冠狀病毒性腹瀉原為比較緩和的疾病,病犬大多能夠康復(fù),但因經(jīng)常與犬細(xì)小病毒等發(fā)生混合感染,而引起嚴(yán)重乃至致死性轉(zhuǎn)歸的疾病。近年來世界上許多國家和地區(qū)都有本病流行的報(bào)道,我國亦已多次發(fā)現(xiàn)本病暴發(fā)。

犬冠狀病毒具有冠狀病毒的一般形態(tài)特征,呈圓形或橢圓形,長徑80~120nm,寬徑為75~80nm;有囊膜,囊膜表面有花瓣?duì)罾w突,長約20nm;核衣殼呈螺旋狀。

 各種品種和年齡的犬都易感,但幼犬癥狀較重,潛伏期1~3天,常迅速蔓延全群。病犬精神萎頓、厭食、嘔吐,隨后排稀軟帶粘液的糊狀糞便,灰白色或黃白色,常有惡臭,有時(shí)呈水樣,橙色至綠色,含有血液。病犬迅速速脫水,消瘦,但體溫常不明顯升高,多數(shù)病例在7~10天內(nèi)康復(fù),某些幼犬可能呈嚴(yán)重癥狀,并因發(fā)熱、脫水和衰竭而死。

二，目的意義

10多年來，中國的寵物市場越來越大，在寵物店，我們能看到琳瑯滿目的寫著英文字母的診斷產(chǎn)品，可食用產(chǎn)品，治療性用品，喜愛寵物的人們不計(jì)價(jià)錢的高低信賴進(jìn)口的產(chǎn)品。即使是開發(fā)抗原診斷試紙產(chǎn)品的原材料--單克隆抗體，也是依賴進(jìn)口，幾年來芬蘭HyTest，韓國金諾JBT 等品牌幾乎如壟斷性的占據(jù)了中國大部分市場，但是由于他們開發(fā)抗體用的免疫原都是分離的他們本國本土的病毒，正如技術(shù)背景所說，在不同國家，不同區(qū)域都可以分離獲得多株病毒，變異程度隨區(qū)域而改變。市場客戶反饋的問題大多于某些株型出現(xiàn)漏檢現(xiàn)象，靈敏度遜色于進(jìn)口產(chǎn)品。本項(xiàng)目通過分離中國區(qū)域內(nèi)不同株病毒，選擇致病強(qiáng)的毒株作為免疫原，耗時(shí)3年多時(shí)間，肩負(fù)著沉重的社會(huì)責(zé)任感，致力于為中國市場提供自給自足的原材料，減弱進(jìn)口的壟斷，至此CDV,CPV,CCV病毒診斷的配對(duì)單抗全新上市，在靈敏度方面、貨期的迅速程度、漏檢控制等方面都做了全新的測試。

• 單抗質(zhì)量鑒定

①免疫熒光鑒定

CDV:

1.Vero細(xì)胞鋪96孔板一個(gè)，同時(shí)接毒，按照5%接毒，每孔接50ul。

   2.第3-5日病變。用0.01Mpbs洗三次后棄掉pbs，拍干。

   3.加入冷乙醇（-20℃存放）固定20分鐘，放入-20℃后棄掉上清，不拍板。

4.pbs洗三次，棄上清，不用拍板，吸干水分。

5.加入一抗，按照0.1 mg/ml加入。37℃防置40分鐘，pbs洗三次，吸干水分。

6.加入二抗（按1:40加入，pbs稀釋）37 ℃防置40分鐘。Pbs洗4次，吸干水分，不拍板，觀察。

7.顯微鏡亮度：1.5亮度

②.注意：1.做不接毒的空白細(xì)胞對(duì)照。

         2.pbs洗要同一位點(diǎn)加入，要溫柔。

         3.鋪板同步接毒。

4.接毒后注意觀察病變情況，出現(xiàn)60%左右的病變測免疫熒光。

圖中顯示37C7  36D9  7G5細(xì)胞株均表現(xiàn)了強(qiáng)熒光。

CPV:

從患病狗糞便中分離細(xì)小病毒，在F81細(xì)胞里體外增值，然后用幾株單抗識(shí)別活病毒的熒光鑒定試驗(yàn)，可以看到，熒光信號(hào)特別強(qiáng)，也就是說這幾株單抗識(shí)別野毒的能力特別強(qiáng)，特異性特別好。

CCV: 感染人的SARS病毒，未做免疫熒光鑒定。檢測時(shí)注意個(gè)人防護(hù)。

②膠體金確認(rèn)鑒定

所開發(fā)CDV檢測卡用于測試病毒培養(yǎng)情況，表明病毒的分布在上清和細(xì)胞內(nèi)均存在。

CDV單抗配對(duì)測試，*代為（5D4-8D1），膠體金條件： 5-6微克蛋白/ml金液，5D4 標(biāo)記；8D1劃線0.5-1mg/ml。經(jīng)過配對(duì)比對(duì)，篩選出了更好的配對(duì)組合，37C7 標(biāo)記；36D9劃線0.5-1mg/ml。（37C7- 36D9 ）配對(duì)的靈敏度是其余組合的3-10倍。

CPV配對(duì)情況（7D6-5B10/5E2）；（4E10-5E2）；（5B10-4E10），可以用于配對(duì)的組合有4組，每一組的靈敏度達(dá)到了低檢測限0.1微克/毫升病毒液。

【膠體金條件】： 5-6微克蛋白/ml金液，劃線0.3-0.5mg/ml，5B10-4E10均可以用于劃線和標(biāo)記，推薦5B10包被，4E10標(biāo)記。

CCV：
 

10份臨床疑似感染樣本，PCR鑒定S基因480pb結(jié)果與此*。

四、配套羊抗鼠與萬能C反應(yīng)蛋白； CDV、cpv純化標(biāo)準(zhǔn)陽性抗原。

五、產(chǎn)品說明書附錄

生產(chǎn)公司：山東綠都生物科技有限公司