DNA羥甲基化定量檢測(cè)試劑盒 （比色法）

介紹

產(chǎn)品特性： 在使用DNA羥甲基化定量檢測(cè)試劑盒（比色法）檢測(cè)全基因組DNA羥甲 基含量時(shí)是非常適合的.不論是從哺乳類(lèi)動(dòng)物,植物,真菌,細(xì)菌,病毒和培養(yǎng)細(xì) 胞,新鮮與冷凍的組織,石蠟包埋組織,血漿/血清樣本,體液樣本. 此品尤其適 合僅有少量樣品在激光顯微捕獲了的解剖樣品和胚胎.

DNA輸入量： 每次DNA的上樣量為50- 200ng。*DNA的輸入量為200 ng,hmDNA 一般都小于0.6%的總DNA。

材料： 材料包括各種組織或細(xì)胞試樣如細(xì)胞培養(yǎng)瓶或酶細(xì)胞、新鮮和冷凍組織, 石蠟包埋組織、血漿/血清樣品,體液樣品等.

內(nèi)控: 此品包含有陽(yáng)性與陰性DNA對(duì)照。一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)曲線可以進(jìn)行(范圍:1－ 10ng)或單個(gè)數(shù)量的羥甲基化的DNA可以作為陽(yáng)性對(duì)照。因?yàn)槿蚪M羥甲 基化是從組織到組織,從正常和病變的區(qū)域,建議確保運(yùn)行復(fù)制樣品信號(hào)的生 成是經(jīng)過(guò)驗(yàn)證的。這個(gè)工具可以讓用戶以量化的數(shù)量或相對(duì)數(shù)量來(lái)確定 羥甲基化的DNA。

預(yù)防措施： 為了避免交叉污染,小心樣品或溶液的加入。在使用移液器進(jìn)行加不同液 體樣本時(shí)，要及時(shí)更換槍頭。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)程序中需要戴手套。且不同樣品之 間的接觸,立即更換手套

一般特性: 質(zhì)控: 每批（比色法）的生產(chǎn),對(duì)既定的各個(gè)組件 的生產(chǎn)把控,確保了穩(wěn)定的產(chǎn)品質(zhì)量。保證所有產(chǎn)品的性能描述都符合行業(yè)的 產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)。

產(chǎn)品概述： (比色法)中含有定量檢測(cè)全基因組羥甲基 化所必需的所有試劑。在檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中，DNA 被固定在一種有 DNA 吸附能力 的孔上，羥甲基化的片段會(huì)被捕獲劑以及檢測(cè)抗體識(shí)別，用熒光分光光度計(jì) 讀取在ex=530+/-20/em=580 +/-20nm處的熒光強(qiáng)度來(lái)定量。羥甲基化的DNA 的量與熒光強(qiáng)度值成線性關(guān)系，可以通過(guò)本試劑盒提供的方程來(lái)計(jì)算兩種不 同的羥甲基化 DNA 樣品的相對(duì)羥甲基化狀態(tài)或者通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線*定量 5-mc?；谄涔ぷ髟砗臀⒖装迥Ｊ?，本試劑盒可以用于各種物種來(lái)源的多 種樣品形式，包括培養(yǎng)的細(xì)胞、新鮮和冷凍的組織、石蠟包埋組織、血漿/ 血清樣品以及體液樣品。

關(guān)于5-hmC 5-hmC 是近年來(lái)在動(dòng)物組織中發(fā)現(xiàn)的，由胞嘧啶修飾而來(lái)。5-hmC 在表 觀遺傳學(xué)上的功能可能與 5-甲基化胞嘧啶(5-mC)不同。盡管到現(xiàn)在為止還不 確知其功能，有研究者猜測(cè)它在調(diào)控基因的表達(dá)與關(guān)閉過(guò)程中起著重要的作 用。5-mC 的發(fā)現(xiàn)讓我們不得不重新評(píng)估 DNA 甲基信息，也不得不監(jiān)測(cè)人類(lèi) 的健康組織和病理組織之間 5-mC 相對(duì)分布的差異。在我司的 DNA 羥甲基化 定量檢測(cè)技術(shù)之前，我們還沒(méi)有發(fā)現(xiàn)任何直接的常規(guī)方法來(lái)檢測(cè)5-hmC,以及 區(qū)分 5-hmC 和 5-mC。

5-hmC 和 5-mC 的區(qū)別 時(shí)下常用的 DNA 甲基化分析方法包括限制內(nèi)切酶酶切和亞硫酸氫鹽后 的定性定量分析或 MeDIP 介導(dǎo)的 MS-PCR 和測(cè)序，這些技術(shù)都不適合用來(lái) 檢測(cè) 5-hmC，因?yàn)樗c 5-mC 事實(shí)上很難用這類(lèi)方法區(qū)分開(kāi)來(lái)。為了解決這 個(gè)問(wèn)題，我司特研制了DNA 羥甲基化定量檢測(cè)試劑盒(熒光法)。本試劑盒提 供了一種很經(jīng)濟(jì)的方法來(lái)檢測(cè)5-羥甲基化胞嘧啶，并且區(qū)分5-hmC, 5-mC, 和 C，使得研究者能夠重新評(píng)估他們的DNA 甲基化信息，也能夠在新樣品中尋 找 DNA 羥甲基化。 zui近，一種新的修正的核苷酸被命名為：5-hmC,且在老鼠的大腦和 胚胎干細(xì)胞中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)。在1952 年，5-hmC *次發(fā)現(xiàn)是在噬菌體內(nèi)。在哺

乳動(dòng)物中，它是由甲基化胞嘧啶氧化所產(chǎn)生的，這是一個(gè)通過(guò) T 族酶和DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶蛋白介導(dǎo)的一個(gè)反應(yīng) 。下面是胞嘧啶的甲基化、羥甲基化形式：

未甲基化 DNA 甲基化 DNA 羥甲基化 DNA T-C-G-T-C-G-A-C-G T-mC-G-T-mC-G-A-mC-G T-hmC-G-T-hmC-G-A-hmC-G

試劑盒曾經(jīng)對(duì)來(lái)自小鼠大腦和海拉細(xì)胞系的樣品成功地進(jìn)行了 5-hmC 的定 量，所得到的結(jié)果與用 HPLC 和 LC-MS 的方法相當(dāng)。通過(guò)使用本試劑盒， 研究者們*在正常人類(lèi)腦部組織和結(jié)腸組織中發(fā)現(xiàn)了高豐度的 5-hmC。同 時(shí)，研究結(jié)果還顯示，正常人類(lèi)腦部組織和結(jié)腸組織中 5-hmC 分別占總甲基 化胞嘧啶(5-mC 和 5-hmC 的總和)的 32%和 16%。相反，在結(jié)腸癌細(xì)胞系 (HCT116)和宮頸癌細(xì)胞系(HeLa)中，5-hmC 的比率很低，幾乎沒(méi)有。 96孔板模式讓您可以根據(jù)自己的需要選擇用手工或者高通量；此試劑盒 中提供通用陽(yáng)性和陰性對(duì)照，能用于定量檢測(cè)各種來(lái)源的 DNA 樣品中的羥 甲基化狀態(tài)，包括哺乳動(dòng)物、植物、真菌、細(xì)菌以及病毒；此試劑盒中含有 定量檢測(cè)全基因組 DNA 羥甲基化實(shí)驗(yàn)所有用到的試劑，包括陽(yáng)性和陰性對(duì) 照。直接測(cè)定熒光強(qiáng)度的方法來(lái)進(jìn)行定量檢測(cè)取代了已過(guò)時(shí)的和劣質(zhì)的方法， 無(wú)須 DNA 消化/變性、提取，不用使用套色版，不接觸放射性材料；本品用 到的新方法和試劑使得羥甲基化 DNA 定量實(shí)驗(yàn)結(jié)果精確、高度靈敏特 異，檢測(cè)極限為 10pg 的羥甲基化DNA，檢測(cè)范圍寬至10pg 到 20ng，檢 測(cè)靈敏度是 HPLC 的十倍(0·008%vs 0·08%)，不與 DNA 上甲基化或者未甲基 化胞嘧啶反應(yīng)，特異檢測(cè)5-hmC。

1) 5-mC轉(zhuǎn)化到 5-hmC 大大降低蛋白質(zhì)的親和力對(duì)于甲基化 DNA； 2) 5-hmC 群系通過(guò)氧化損傷或借助外源的醛式的DNMTs能夠防止參與的 DNMT目標(biāo)胞嘧啶不被甲基化 3) 5-hmC可能會(huì)吸收特異性的蛋白，并致使染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變或DNA 甲基化模式的改變 4) 5-hmC 分布在 40%的甲基化胞嘧啶的蒲金耶氏細(xì)胞（Purkinjecells）中, 有 10%在顆粒神經(jīng)元（granule neurons）中.

本試劑盒有以下優(yōu)點(diǎn)和特性： l 整個(gè)比色法檢測(cè)技術(shù)的操作簡(jiǎn)單易學(xué)，方便快捷，只需要3 小時(shí)45 分鐘 就能完成實(shí)驗(yàn)； l 靈敏度高,檢測(cè)極限低至40pg 羥甲基化的DNA； l 對(duì)于未甲基化和甲基化的胞嘧啶無(wú)特異性,僅對(duì)羥甲基化 DNA（5-hmC） 進(jìn)行高度專(zhuān)一的檢測(cè); l 通用型的陽(yáng)性與陰性對(duì)照,對(duì)于任何種屬的羥甲基化 DNA 狀態(tài)進(jìn)行定量 檢測(cè)是非常理想的； l 微孔板（96孔）的設(shè)計(jì)使實(shí)驗(yàn)更靈活,無(wú)論對(duì)于手動(dòng)還是高通量分析； l 簡(jiǎn)單、可信和檢測(cè)實(shí)驗(yàn)條件恒定。

原理/程序: (比色法)包含全基因組 DNA 羥甲基化定量的 所有試劑。在此試驗(yàn)中，DNA必定會(huì)跑出經(jīng)過(guò)處理后的具有高親和性的DNA 條帶。在檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中，DNA被固定在一種有DNA吸附能力的孔上，羥甲基化 的片段會(huì)被捕獲劑以及檢測(cè)抗體識(shí)別，然后使用熒光分光光度計(jì)讀RFU(相對(duì) 熒光單位)，對(duì)其進(jìn)行熒光法定量。羥甲基化的DNA的量同測(cè)量的OD成比例。