總體DNA羥甲基極易定量檢測試劑盒（比色法）

介紹

產(chǎn)品特性： 總體DNA羥甲基極易定量檢測試劑盒（比色法）檢測全基因組DNA羥甲基含量是非常 適合的.不論是從哺乳類動(dòng)物,植物,真菌,細(xì)菌,病毒和培養(yǎng)細(xì)胞,新鮮與冷凍的組織,石蠟包埋 組織,血漿/血清樣本,體液等樣本. 此品尤其適合僅有少量樣品在激光顯微捕獲了的解剖樣 品和胚胎。不論是單鏈DNA和雙鏈DNA，片段在200bp到全長都很適用。

DNA輸入量：     每次分析DNA的上樣量為20 - 200ng。*DNA的輸入量為100 ng,在某些種屬中，組 織樣本間的甲基化的DNA含量一般都小于0.6%的總DNA。

起始材料：     材料包括各種組織或細(xì)胞樣本如細(xì)胞培養(yǎng)瓶或微孔板培養(yǎng)的細(xì)胞、新鮮和冷凍組織,石 蠟包埋組織、血漿/血清樣品,體液樣品等

產(chǎn)品概述： 總體 DNA 羥甲基極易定量檢測試劑盒（比色法）中含有定量檢測全基因組羥甲基化所 必需的所有試劑。在檢測實(shí)驗(yàn)中，DNA 被固定在一種有 DNA 吸附能力的孔上，甲基化的片 段會(huì)被捕獲劑以及檢測抗體識(shí)別，用酶標(biāo)儀讀取在 450 nm 處的 OD 值來定量。羥甲基化的 DNA 的量與 OD 值成線性關(guān)系，可以通過本試劑盒提供的方程來計(jì)算兩種不同的甲基化 DNA 樣品的相對(duì)甲基化狀態(tài)或者通過標(biāo)準(zhǔn)曲線*定量 5-hmc?；谄涔ぷ髟砗臀⒖装迥Ｊ?， 本試劑盒可以用于各種物種來源的多種樣品形式，包括培養(yǎng)的細(xì)胞、新鮮和冷凍的組織、石 蠟包埋組織、血漿/血清樣品以及體液樣品

相關(guān)知識(shí)擴(kuò)展了解：關(guān)于 5-hmC     5-hmC 是近年來在動(dòng)物組織中發(fā)現(xiàn)的，由胞嘧啶修飾而來。5-hmC 在表觀遺傳學(xué)上的功 能可能與 5-甲基化胞嘧啶(5-mC)不同。盡管到現(xiàn)在為止還不確知其功能，有研究者猜測它在 調(diào)控基因的表達(dá)與關(guān)閉過程中起著重要的作用。5-mC 的發(fā)現(xiàn)讓我們不得不重新評(píng)估 DNA 甲 基信息，也不得不監(jiān)測人類的健康組織和病理組織之間 5-mC 相對(duì)分布的差異。在我公司的 DNA 羥甲基化定量檢測技術(shù)之前，我們還沒有發(fā)現(xiàn)任何直接的常規(guī)方法來檢測 5- hmC,以及 區(qū)分 5-hmC 和 5-mC。  

5-hmC 和 5-mC 的區(qū)別     時(shí)下常用的 DNA 甲基化分析方法包括限制內(nèi)切酶酶切和亞硫酸氫鹽后的定性定量分析 或 MeDIP 介導(dǎo)的 MS-PCR 和測序，這些技術(shù)都不適合用來檢測 5-hmC，因?yàn)樗c 5-mC 事實(shí) 上很難用這類方法區(qū)分開來。為了解決這個(gè)問題，我司特研制了 DNA 羥甲基化定量檢測試 劑盒(熒光法)。本試劑盒提供了一種很經(jīng)濟(jì)的方法來檢測 5-羥甲基化胞嘧啶，并且區(qū)分 5-hmC, 5-mC, 和 C，使得研究者能夠重新評(píng)估他們的 DNA 甲基化信息，也能夠在新樣品中尋找 DNA 羥甲基化。     zui近，一種新的修正的核苷酸被命名為：5-hmC,且在老鼠的大腦和胚胎干細(xì)胞中已經(jīng)發(fā) 現(xiàn)。在1952年，5-hmC*次發(fā)現(xiàn)是在噬菌體內(nèi)。在哺乳動(dòng)物中，它是由甲基化胞嘧啶氧化 所產(chǎn)生的，這是一個(gè)通過T族酶和DNA甲基轉(zhuǎn)移酶蛋白介導(dǎo)的一個(gè)反應(yīng) 。下面是胞嘧啶的甲 基化、羥甲基化形式：

     未甲基化 DNA           甲基化 DNA          羥甲基化 DNA    T-C-G-T-C-G-A-C-G     T-mC-G-T-mC-G-A-mC-G  T-hmC-G-T-hmC-G-A-hmC-G  

試劑盒曾經(jīng)對(duì)來自小鼠大腦和海拉細(xì)胞系的樣品成功地進(jìn)行了 5-hmC 的定量，所得到 的結(jié)果與用 HPLC 和 LC-MS 的方法相當(dāng)。通過使用本試劑盒，研究者們*在正常人類腦部 組織和結(jié)腸組織中發(fā)現(xiàn)了高豐度的 5-hmC。同時(shí)，研究結(jié)果還顯示，正常人類腦部組織和結(jié) 腸組織中 5-hmC 分別占總甲基化胞嘧啶(5-mC 和 5-hmC 的總和)的 32%和 16%。相反，在結(jié) 腸癌細(xì)胞系(HCT116)和宮頸癌細(xì)胞系(HeLa)中，5-hmC 的比率很低，幾乎沒有。

一些核苷酸的修飾改變，5-羥甲基胞嘧啶，5-甲?；奏?，5-羧基胞嘧啶，已經(jīng)被發(fā) 現(xiàn)在人類和小鼠的組織以及胚胎干細(xì)胞中。在哺乳動(dòng)物中，這些修飾的核苷酸可通過 5-甲 基胞嘧啶的氧化反應(yīng)得到，中間伴隨有 TET 酶家族介導(dǎo)的反應(yīng)。

這條技術(shù)路線圖表明：胞嘧啶的不同存在形式在調(diào)節(jié)基因功能中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用，其 中 DNA 羥甲基的結(jié)構(gòu)和模式尤為重要。 精確和便利的檢測 5-hmC 水平，對(duì)于 DNA 在不同的生理和病理過程中的變化，變得非 常重要，尤其是癌癥?；谏V分析技術(shù)比如：HPLC 和質(zhì)譜分析法：TLC 來檢測 5-hmC。但 是，這些方法耗時(shí)，通量低，高成本。為了解決這些問題，我們的技術(shù)團(tuán)隊(duì)提供了一系列羥 甲基化 DNA定量檢測的方法來定量檢測 5-hmC或羥甲基化的 DNA和更為深入的改變羥甲基 化 DNA 實(shí)驗(yàn)，優(yōu)化出了：總體 DNA羥甲基極易定量檢測試劑盒（比色法）。

本試劑盒有以下優(yōu)點(diǎn)和特性： l 快速：減少的步驟，整個(gè)操作僅需要 2 小時(shí)； l 穩(wěn)定性：優(yōu)化的試劑盒組分，允許在做復(fù)孔時(shí)，有更大的“觸發(fā)信號(hào)”，盡量減少變化；

 l 方便性：固定的低背景噪音，從而消除了 DNA 變性和板孔的限定性； l 靈敏度：檢測下限低至 0.01%的羥甲基化 DNA，輸入量在 100ng； l 特異性：高效特異結(jié)合 5-hmC，在復(fù)孔的濃度范圍內(nèi)，對(duì)于未甲基化的胞嘧啶和羥甲基 的胞嘧啶無特異性反應(yīng)，僅對(duì)羥甲基化 DNA（5-hmC）進(jìn)行高度專一的檢測; l 通用型：陽性與陰性對(duì)照，對(duì)于任何種屬的羥甲基化 DNA 狀態(tài)進(jìn)行定量檢測是非常理 想的； l 精確性：標(biāo)準(zhǔn)的陽性對(duì)照可以得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，可以與 HPLC-MS 相媲美，用時(shí)短，效率 高，。 l 靈活性：微孔板（96 孔）的設(shè)計(jì)使實(shí)驗(yàn)更靈活，無論對(duì)于手動(dòng)還是高通量分析簡單、 可信和檢測實(shí)驗(yàn)條件恒始終如一。

注：基于同一樣本分 2 份來測定。

 原理/程序: （比色法）包含全基因組 DNA 羥甲基化定量檢測的所 有試劑。在此實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)特殊處理且具有高親和性的DNA必定會(huì)結(jié)合在微孔板上。在檢測實(shí) 驗(yàn)中，DNA被固定在一種有DNA吸附能力的孔上，羥甲基化的片段會(huì)被捕獲抗體以及檢測抗 體識(shí)別，然后使用酶標(biāo)儀測出 450 nm 處的吸光值，對(duì)其進(jìn)行比色法定量。羥甲基化DNA 的量同測量的OD值成比例