微型高效氯霉素免疫親和純化富集柱

使用說明書

用途                                                                         

我所通過合作，應(yīng)用*進(jìn)技術(shù)研制的微型高效氯霉素免疫親和純化富集柱（號(hào)：2013091200151300）性能穩(wěn)定、可以重復(fù)使用(*次使用回收率101.3%，第二次回收率達(dá)到96%，第三次回收率達(dá)62%)；吸附容量大（如氯霉素達(dá)到52.72ug/ml,）；吸附靈敏度（zui低富集）達(dá)到0.1ng/ml。

此免疫親和柱可選擇性吸附樣品液中的氯霉素，從而對(duì)氯霉素樣品起到特異性純化和富集的作用。樣品過柱后的洗脫液既可結(jié)合ELISA測(cè)試盒或膠體金試紙條進(jìn)行檢測(cè)，也可聯(lián)合液相色譜進(jìn)行精確定量。親和柱的使用可以改善信噪比，提高檢測(cè)方法的準(zhǔn)確度。

氯霉素                                                             

氯霉素（Chloramphenicol，CAP）是一種廣譜抗生素。醫(yī)學(xué)臨床和獸醫(yī)曾用來治療人及動(dòng)物的多種感染性疾病。但氯霉素有嚴(yán)重的毒副作用，已被臨床醫(yī)學(xué)和動(dòng)物生產(chǎn)上禁止使用。但仍存在屢禁不止的情況，食品中氯霉素的殘留嚴(yán)重危害人體健康。

富集原理                                                           

親和柱富集的原理是抗原抗體的特異性反應(yīng)。樣品經(jīng)過提取、過濾、稀釋，然后緩慢的通過氯霉素免疫親和柱，樣品中的氯霉素與偶聯(lián)在瓊脂糖珠上的抗體結(jié)合，洗滌掉雜質(zhì)后，根據(jù)后續(xù)檢測(cè)需要選用洗脫液洗脫，收集的洗脫液可以用于儀器分析，或用于免疫學(xué)檢測(cè)方法檢測(cè)。

產(chǎn)品包裝組成                                                       

注意事項(xiàng)                                                           

1．親和柱在不使用時(shí)，需放置在-20℃保存，其他試劑放在2-8℃保存，并確保在有效期內(nèi)使用。

2．柱子的填料應(yīng)保持濕潤(rùn)，在保存、清洗、上樣、洗脫的過程中不能出現(xiàn)填料干燥的情況。

3．在操作中，填料里盡量不要有氣泡，以免影響流速。

4．實(shí)驗(yàn)完后需對(duì)所用材料、容器、設(shè)備做適當(dāng)處理。

5．洗脫液里的乙酸容易揮發(fā)，請(qǐng)密封保存；若乙酸揮發(fā)完，不能使用，需要重新配制。

樣品處理                                                           

牛奶樣品：稱取牛奶樣品5g(精確至0.01g),置于50mL塑料離心管中，加入適量的氯霉素氘代內(nèi)標(biāo)（氯霉素-D5）和乙腈30mL,勻漿，離心5min。將上清液移250mL的分液漏斗中，加入15mL的乙腈飽和的正己烷，振蕩5min，靜置分層，轉(zhuǎn)移乙腈層至100mL的棕色心形瓶中，殘?jiān)性偌尤?0 mL的乙腈，振搖3min，離心5min，取上清液轉(zhuǎn)移到同一分液漏斗中，振蕩5min，靜置分層，轉(zhuǎn)移乙腈層至棕色心形瓶中。向心形瓶中加入5mL正丙醇，于40度水浴中旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)近干，用氮?dú)獯蹈?，分次加?5mL PBS溶解,全部轉(zhuǎn)移至離心管中，待親和柱凈化。

組織樣品：將樣品搗碎，取5.0 g（精確到1mg）于50 mL離心管中并加入20 mL乙酸乙酯，充分混勻后放入離心機(jī)5000 r/min離心10 min，取10 mL上清液于45℃下氮?dú)獯蹈桑蹈珊髿埩粑镉?0 mL的甲醇-水（10:90）溶解后,于4000 r/min離心5 min，并用定性濾紙過濾。收集濾液，用飽和Tris調(diào)節(jié)PH=7.0±0.5，待親和柱凈化。

飼料樣品：稱取一定量的試樣（配合飼料5.00 g，預(yù)混合飼料1.00 g），置于50mL塑料離心管中，加入40 mL乙酸乙酯，蓋好密封蓋于渦旋混合器上混合2min，超聲波提取器提取20min，期間用手搖動(dòng)兩次，離心機(jī)4000 r/min離心4 min，取上清液20mL，于50℃加熱器上用氮?dú)獯抵两?，殘留物?0 mL的甲醇-水（10:90）溶解后,于4000 r/min離心5 min，并用定性濾紙過濾。收集濾液，用飽和Tris調(diào)節(jié)PH=7.0±0.5，待親和柱凈化。

操作程序                                                           

1．自冰箱取出免疫親和柱，在室溫（22～25℃）平衡10 min，將上方塞和下方塞子取出。上方接上已經(jīng)去掉活塞的注射器。親和柱內(nèi)含有甘油作為保護(hù)劑，使用時(shí)應(yīng)該將上方的甘油全部吸取出來。

2．清洗①：將親和柱固定好，往注射器內(nèi)加入1 mL PBS，用活塞從注射器上方輕輕按壓，使PBS勻速流出，但不要*擠壓出PBS，注意保持柱內(nèi)填料含有液體。

3．上樣：準(zhǔn)確量取5mL（上樣量可以根據(jù)實(shí)際情況做調(diào)整）處理后的樣品液于注射器內(nèi)，用活塞加壓控制流速為1滴/2 s，棄去流出液。樣液過柱的方式有：自然流淌、手動(dòng)加壓（產(chǎn)品配備的注射器）、真空泵抽濾。可根據(jù)實(shí)際情況需要選擇不同的過柱方式。

4．清洗②： 待樣品滴凈后，依次加入2 mL PBSt、2 mL PBS清洗。洗法同清洗①。

5．去掉注射器，根據(jù)后續(xù)檢測(cè)需要，選擇洗脫液A或洗脫液B其中的一種，加入0.2 mL（洗脫液總量可以根據(jù)實(shí)際情況作調(diào)整），洗脫液自然滴下，用EP管接收洗脫液（接洗脫液時(shí)，流出*滴洗脫液不要）。

6．將收集到的洗脫液轉(zhuǎn)入儀器分析或采用ELISA/膠體金檢測(cè)（用作ELISA/膠體金的收集液必須用飽和Tris調(diào)節(jié)PH=7.0±0.5）。

7．保質(zhì)期一年。

再生使用方法：依次用0.2mL的PBSt、1mL的PBS清洗親和柱，直到流出來的清洗液PH值為7左右，zui后用0.2ml的甘油保存。本微型高效免疫親和純化富集柱經(jīng)過再生處理后可以重復(fù)使用多次。