NGS在腫瘤檢測(cè)中的那些事兒

一、背景介紹

20世紀(jì)以來，癌癥已成為困擾人類健康的主要危害之一。根據(jù)2019年國家癌癥中心發(fā)布的2015年全國//////新癌癥統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，2015年惡性腫瘤發(fā)病約392.9萬人，死亡約233.8萬人。平均每天超1萬人被確診為癌癥，每分鐘7.5個(gè)人確診癌癥。癌癥負(fù)擔(dān)呈持續(xù)上升態(tài)勢(shì)，近10多年來，惡性腫瘤發(fā)病率每年保持約3.9％的增幅，死亡率每年保持2.5％的增幅。因而腫瘤基因突變檢測(cè)對(duì)指導(dǎo)腫瘤靶向治療、耐藥監(jiān)測(cè)及預(yù)后判斷有重要意義。

圖1：中國2015年惡性腫瘤發(fā)病與死亡人數(shù)圖

二、腫瘤突變類型

腫瘤突變主要來源于體細(xì)胞突變和胚系突變。

胚系突變(germline mutation)又稱生殖細(xì)胞突變，是來源于精子或者卵子這些生殖細(xì)胞的突變，因此身上所有的細(xì)胞都帶有突變，目前主要是BRCA1/2，一般研究較少。

體細(xì)胞突變(somatic mutation)又稱獲得性突變，是指在生長發(fā)育過程中或者環(huán)境因素影響下后天獲得的突變，通常身上只有部分細(xì)胞帶有突變。

圖2：基因突變類型解析圖

體細(xì)胞突變包括序列變異、結(jié)構(gòu)變異、腫瘤突變負(fù)荷（TMB）和微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（MSI）。其中序列變異包括SNV(Single Nucleotide Variation)和Indel（Insertion & deletion）。結(jié)構(gòu)變異包含Deletion、Duplication、Inversion和Translocation。

圖3：序列變異和結(jié)構(gòu)變異解析圖

名詞解釋：

TMB就是基因中發(fā)生錯(cuò)誤的密碼總量。TMB越高，那么可能相應(yīng)的腫瘤相關(guān)的致癌突變?cè)蕉啵總€(gè)腫瘤的個(gè)性就越突出，越不同于正常細(xì)胞。腫瘤免疫治療的原理就是通過加強(qiáng)機(jī)體免疫系統(tǒng)對(duì)腫瘤的識(shí)別和殺傷。而腫瘤突變負(fù)荷越大（TMB越高），突變?cè)蕉嗟陌┘?xì)胞，越不像正常細(xì)胞，越容易被免疫細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，自然無法逃脫免疫系統(tǒng)的追殺。一般認(rèn)為TMB超過20個(gè)突變/Mb（Mb代表的就是每百萬個(gè)堿基）就是高，低于10個(gè)突變/Mb就是低。當(dāng)然，不同的公司，由于所采用的基因套餐以及技術(shù)不同，略有差異。

MSI指的是微衛(wèi)星不穩(wěn)定性，指的是在DNA復(fù)制過程中段片段插入或者缺失突變引起的微衛(wèi)星序列長度改變的現(xiàn)象，通常由錯(cuò)配修復(fù)MMR功能缺陷引起。以二核苷酸重復(fù)序列（CA/GT）n///為常見，n一般是15-60次。MSI在維持基因組穩(wěn)定以及調(diào)控基因表達(dá)中發(fā)揮重要作用，且個(gè)體差異較大。

三、常見的腫瘤突變檢測(cè)技術(shù)

傳統(tǒng)的腫瘤檢測(cè)方法包括Sanger測(cè)序、焦磷酸測(cè)序和實(shí)時(shí)熒光PCR等，僅能對(duì)單個(gè)基因或者單個(gè)基因的外顯子突變進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)復(fù)雜變異類型的檢測(cè)存在局限性。高通量測(cè)序（Nextgeneration sequencing,NGS）能夠同時(shí)對(duì)上百萬甚至數(shù)十億個(gè)DNA///片段進(jìn)行測(cè)序，因此可以在較低的成本下對(duì)多至上百個(gè)腫瘤相關(guān)基因、全外顯子及全基因組進(jìn)行檢測(cè)。

四、應(yīng)用NGS進(jìn)行腫瘤檢測(cè)的技術(shù)路線

NGS進(jìn)行腫瘤基因突變檢測(cè)的技術(shù)路線主要包括：全基因組測(cè)序（WGS）、全外顯子測(cè)序（WES）和靶向捕獲測(cè)序（targeted sequencing）。

圖4：腫瘤檢測(cè)技術(shù)路線圖

全基因組測(cè)序：

全基因組測(cè)序可對(duì)整個(gè)基因組區(qū)域進(jìn)行測(cè)序，包括編碼區(qū)、非編碼區(qū)等所有的基因區(qū)域進(jìn)行測(cè)序?？蓪?shí)現(xiàn)對(duì)人類基因組范圍內(nèi)所有的變異類型進(jìn)行分析，包括SNV、 Indel,、CNV和 SV，甚至可以進(jìn)行染色體水平變異的分析。弊端是測(cè)序需要很大的數(shù)據(jù)量，成本高，而且其中以大部分?jǐn)?shù)據(jù)目前尚不能解釋，因此離實(shí)際臨床應(yīng)用還存在較大距離。

全外顯子測(cè)序：

全外顯子測(cè)序可對(duì)基因組上所有的基因外顯子區(qū)域進(jìn)行測(cè)序。全外顯子覆蓋人類基因組1-2%的蛋白質(zhì)編碼序列。相比于WGS減少了對(duì)非編碼區(qū)的測(cè)序，成本更低，并且可以獲得更高的測(cè)序深度和檢測(cè)分辨率。但WES對(duì)于臨床檢測(cè)來說，腫瘤基因檢測(cè)測(cè)序深度較高，所需的數(shù)據(jù)量相對(duì)較高，因此從臨床應(yīng)用以及成本考慮，WES并未被廣泛接受。

靶向捕獲測(cè)序：

靶向測(cè)序是指選擇基因組上感興趣的基因或基因區(qū)域作為靶向檢測(cè)區(qū)域，可以是幾個(gè)基因上的個(gè)別外顯子區(qū)域，也可以是幾百上千個(gè)基因上的全部外顯子區(qū)域。靶向測(cè)序兼顧了實(shí)際檢測(cè)需求，又降低了測(cè)序成本，因此目前在臨床上的應(yīng)用///為廣泛。常見方法主要有：探針雜交捕獲以及多重PCR擴(kuò)增。

五、小結(jié)

腫瘤問題屬于世界性難題，一直威脅著人類的健康，是人類生命健康的死敵。近幾年隨著精準(zhǔn)醫(yī)療的快速發(fā)展，生命醫(yī)療與生物科學(xué)的準(zhǔn)確對(duì)接，NGS已經(jīng)逐步滲透到腫瘤病理分子診斷領(lǐng)域，大大豐富了腫瘤基因診斷的內(nèi)容。NGS是目前常用的有效獲取人類癌癥基因組信息的高通量測(cè)序方法，能夠勾畫出腫瘤相關(guān)的遺傳變異全景，NGS技術(shù)為腫瘤精準(zhǔn)醫(yī)療的進(jìn)一步發(fā)展提供了基礎(chǔ)。

六、高效建庫，成就腫瘤突變精準(zhǔn)

產(chǎn)品名稱：Hieff NGS® OnePot DNA Library Prep Kit for Illumina®  （點(diǎn)這里）

產(chǎn)品特點(diǎn)：
1）建庫流程更簡(jiǎn)便：片段化/末修/加A一步完成，大大縮減建庫時(shí)間；

2）酶切可控時(shí)間長：酶切效果僅與時(shí)間有關(guān)，與物種來源以及樣本GC含量無關(guān)；

3）接頭連接更高效：接頭雙端連接效率高于60%，業(yè)內(nèi)領(lǐng)///先；

4）文庫擴(kuò)增更均一：高深度測(cè)序條件下，均一性與KAPA HiFi Ready-mix高度一致；

5）突變檢出更高效：突變檢出頻率與標(biāo)準(zhǔn)品預(yù)期突變更接近。

性能展示：結(jié)果表明翊圣建庫試劑盒突變檢出更高效。

【注】：實(shí)驗(yàn)樣本：Horizon@HD701: Quantitative Multiplex Reference Standard gDNA

七、產(chǎn)品信息

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